清热解毒法在恶性肿瘤治疗中的临床应用

现代中医肿瘤学的癌毒病机理论提出,清热解毒法为治疗恶性肿瘤的抗癌解毒八法之一,可在恶性肿瘤治疗中广泛应用。清热解毒法治疗恶性肿瘤的临床应用需基于辨证、辨病、分期、辨体相结合的综合辨治模式。若肿瘤患者热毒证候明显,辨证应用清热解毒法无疑;若热毒不明显或无证可辨,结合现代肿瘤的病理本质特征,在不违背整体遣方用药原则下,可辨病应用清热解毒法以发挥抗癌祛毒之效。清热解毒法本质属于攻法,其辨证或辨病应用均应以患者正气强弱为考量因素,同时还需结合患者的肿瘤分期、体质因素等。辨证应用强调了清热解毒法运用于肿瘤热毒证的普遍性,辨病应用突破了清热解毒法仅用于宏观热毒证的局限性,分期应用体现了清热解毒法阶段性使用的精准性,辨体应用则体现了清热解毒法应用过程中的个体性。辨证、辨病、分期、辨体4种辨治模式当相互参照、综合运用,方可取得显效。治疗肿瘤常用的清热解毒药物有白花蛇舌草、半枝莲、重楼、天葵子、漏芦、山豆根等。

参白解毒方显著抑制小鼠结直肠腺瘤的形成及癌变:基于PTEN/PI3K/AKT通路

目的 探讨参白解毒方(SBJDF)对结直肠腺瘤形成及癌变的影响及其对PTEN/PI3K/AKT信号通路的调控作用。方法 将4周龄的雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组(10只)、AOM/DSS模型组(20只)、参白解毒方低剂量组(14 g/kg,10只)和参白解毒方高剂量组(42 g/kg,10只)。除对照组外,其余各组采用AOM/DSS诱导小鼠结直肠腺瘤癌变模型,处理组于造模中给予参白解毒方灌胃干预。比较各组小鼠的生存率、体质量和生存状态,观察肠道组织腺瘤形成及癌变等病理情况,免疫组化检测肠道组织PTEN/PI3K/AKT信号通路相关分子的表达。结果 参白解毒方干预后小鼠的肿瘤发生率、数量和体积均显著低于AOM/DSS模型组,且高剂量的参白解毒方抑制效果更佳。HE病理切片结果显示模型组已形成腺癌,而参白解毒方可以抑制腺瘤的形成及癌变,参白解毒方低剂量组小鼠肠道同时存在腺瘤低级别瘤变和高级别瘤变,参白解毒方高剂量组小鼠肠道以正常粘膜组织为主,仅发现局部少量腺瘤低级别瘤变。机制研究发现模型组血浆中miRNA-222表达高于空白组(P<0.05),用药各组miRNA-222的表达量较模型组下调(P<0.01);小鼠肠道组织免疫组化结果显示,与AOM/DSS模型组相比,参白解毒方处理后PTEN、p-PTEN、GSK-3β表达上调,且在低剂量组、高剂量组表达有依次递增趋势;p-GSK-3β、PI3K、AKT、p-AKT、β-catenin、c-myc、CyclinD1、Survivin表达下调,且在低剂量组、高剂量组表达呈递减趋势。结论 参白解毒方可以显著抑制小鼠结直肠腺瘤形成及癌变,其作用机制可能与调控miRNA-222及影响PTEN/PI3K/AKT信号通路有关。

不利工况下装配式建筑外挂脚手架稳定性分析

通过理论研究和ANSYS有限元模拟,对不利工况下装配式建筑外挂脚手架进行稳定性分析.理论分析得出:窗户位置,采用延长三角支座立杆的方式;阳台位置,采用延长三角支座横杆的同时还应当进行加固.外挂架的三角支座上端螺栓稳定性作用效果大于下端;螺栓锚固定在现浇位置挂架受力更为可靠.水平风荷载不能忽略;考虑水平地震作用,应当减少挂架对应高度处的荷载.有限元分析得出:三角支座立杆和横杆长度宜设计为800 mm和600 mm.水平面荷载对挂架稳定性影响远大于竖向面荷载.斜杆上半段、脚手板宽度方向杆和临边防护边缘竖直杆分别对三角支座、脚手板骨架和临边防护稳定性影响最大.

预知子提取物增敏奥沙利铂诱导结肠癌HCT116细胞凋亡的研究

目的探讨预知子提取物增敏奥沙利铂(OXA)诱导结肠癌HCT116细胞凋亡的作用及机制,为减少OXA毒副作用发生的临床应用提供研究基础。方法将预知子乙酸乙酯萃取成分进行中压柱层析分离,并进行抗肿瘤药效筛选,获取活性部位B14,并进一步分离和鉴定该活性部位成分;运用MTT法检测B14、OXA及二者联用对HCT116的增殖抑制作用;采用CompuSyn软件评价联合药效,确定药物联用最佳剂量;流式细胞术检测B14与OXA联用后HCT116细胞的凋亡率及周期分布;Western blot法检测凋亡及信号通路相关蛋白的表达水平。结果筛选确定预知子活性部分B14,检测并明确其主要成分为皂苷B和α-常春藤皂苷;6μg·mL^(-1) B14可显著促进15μg·mL^(-1) OXA对HCT116细胞的增殖抑制作用(P<0.001),促进细胞凋亡(P<0.001);联合组细胞周期被阻滞于G2/M期(P<0.001);Western blot结果显示,与OXA组比较,联合组Bcl-2、Caspase-3及Bcl-2/Bax比值显著降低(P<0.01,P<0.001),Bax、Cyt-c、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-3/Caspase-3比值及p-p38 MAPK显著升高(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。结论预知子提取物具有增敏OXA诱导HCT116凋亡的作用,其机制可能与阻滞细胞周期在G_(2)/M期及激活p38 MAPK介导的线粒体凋亡通路有关。研究结果为降低OXA毒副作用的临床应用提供了线索。

缺氧微环境下仙连解毒方通过调控HIF-1α影响结直肠癌细胞迁移的作用及机制研究

目的 通过体外实验研究缺氧微环境下仙连解毒方(Xian-Lian-Jie-Du-Formula,XLJDF)抑制结直肠癌细胞迁移的有效性及其潜在机制。方法 厌氧细胞培养箱(95%N2、5%CO_(2),O_(2)浓度<1%)中培养人结直肠癌细胞HCT-116,MTT比色法检测XLJDF对细胞活力的影响;伤口愈合实验和细胞迁移实验(Transwell法)检测XLJDF对细胞迁移能力的作用;取对数生长期的细胞分组进行转染和慢病毒感染,RTPCR检测HCT-116细胞中HIF-1α mRNA的表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测HCT-116细胞中HIF-1α、EMT相关蛋白的表达情况及XLJDF对TGF-β/smad信号通路的调控作用。结果 缺氧条件下,XLJDF能抑制HCT-116细胞活性(P<0.05或P<0.01)。细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验示,XLJDF干预后,与空白对照组相比,细胞迁移速率显著降低(P<0.05或P<0.01),传入下室的细胞数目显著减少(P<0.05或P<0.01);与空载体组对比,XLJDF能降低HIF-1α过表达细胞株的细胞迁移速率(P<0.05或P<0.01)和减少传入Transwell下室的细胞数(P<0.05或P<0.01)。Western blot法检测EMT、TGF-β/Smad通路相关蛋白表达,与常氧组相比,缺氧条件下细胞内HIF-1α蛋白表达水平显著升高,且在24 h内呈时间依赖性;XLJDF各浓度干预组,E-钙粘蛋白(E-cadherin)的表达水平显著上升,N-钙粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、TGF-β1、p-Smad3的表达量均降低(P<0.05或P<0.01)。结论 缺氧微环境下仙连解毒方能减弱结直肠癌细胞HCT-116迁移能力,调控HIF-1α介导的TGF-β/smad信号通路激活、逆转EMT可能是其潜在机制之一。

基于蛋白质组学探讨仙连解毒方干预小鼠结直肠癌湿热瘀毒证模型的作用靶点及信号通路研究

目的应用蛋白质组学方法探讨仙连解毒方(Xian-Lian-Jie-Du Decotion,XLJDD)治疗小鼠结直肠癌湿热瘀毒证模型的作用靶点及信号通路。方法采用偶氮甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸钠(DSS)结合高糖高脂饲料喂养的复合方法建立小鼠结直肠癌湿热瘀毒证模型,将小鼠分为空白对照(Control)组、湿热瘀毒证模型(Model)组、仙连解毒方处理(XLJDD)组。XLJDD组于造模同时开始给药(12.9 g·kg^(-1)),每周6次,共112天,末次给药4 h后,收集各组小鼠结直肠组织,迅速液氮保存。蛋白质质谱检测采用非数据依赖型采集模式(DIA),通过Protein Discovery 2.2软件进行蛋白质搜库鉴定,对蛋白及肽段信息定量分析,筛选各组差异表达蛋白,并对差异蛋白进行GO(Gene Oncology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析。结果Model组与Control组相比,共有差异表达蛋白267个,XLJDD组与Model组相比,共有225个差异表达蛋白,GO以及KEGG富集分析发现仙连解毒方干预后,发现这些蛋白主要定位在细胞膜上,能够发挥细胞调节功能等分子功能,参与细胞粘附、Th1/Th2细胞分化、Th17细胞分化和细胞衰老通路等生物学进程相关。结论通过蛋白质组学研究提示,XLJDD可能通过调节免疫细胞功能,发挥干预小鼠结直肠癌湿热瘀毒证的作用。

商业银行非利息收入业务对其经营绩效影响的实证研究

本文运用我国13家上市商业银行2007—2013年的年度财务数据构建面板数据模型,探讨商业银行非利息收入业务与其经营绩效水平的关系。研究结果表明:提高非利息收入的比重对我国商业银行经营绩效水平会产生正向的影响,大力开展非利息收入业务有助于增强商业银行的盈利能力。

创业:造就不平凡的人生

平凡的人生，总有些不平凡的事情发生：创业的成败已经不重要了，成功的关健并不完全是赚钱而是创造人生价值；人生在世，总想做点对自己有价值的事业和工作。对于青年的朋友在就业与创业的道路上迷失了自己是很正常的现象，但对创业者就业者来说必需要思考点问题，做点有意义并有人生价值的事情，对于那些正在寻找出路和寻找就业的机会青年男女多多少少学会点就业常识，也同样是必要的。

基于转录组测序探讨湿热蕴结证结直肠腺瘤癌变的生物学基础及参白解毒方作用机制

目的:探讨结直肠腺瘤湿热蕴结证的生物学基础及临床有效方药参白解毒方可能的抗肿瘤作用机制。方法:临床获取2019年2月至2020年12月江苏省中医院招募的符合纳入标准的结直肠腺瘤湿热蕴结证患者8例、非湿热蕴结证者11例和结直肠癌患者10例,对3组患者组织进行转录组测序,筛选证候间及疾病间差异表达基因,并对证候和疾病间差异基因取交集,进一步筛选在非湿热蕴结证、湿热蕴结证和结直肠癌患者中依次递增或依次递减的差异基因,进行功能富集分析和信号通路富集分析。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测参白解毒方对上述关键差异基因表达的影响。结果:湿热蕴结证和非湿热蕴结证对比,筛选出差异表达基因共384个,其中表达上调基因203个,表达下调基因181个;结直肠癌与湿热蕴结证结直肠腺瘤比较,筛选出差异表达基因共2965个,其中表达上调基因2460个,表达下调基因505个;将2组差异基因取交集,并筛选同向变化的差异基因共58个;基因本体功能主要富集在UDP-半乳糖:β-N-乙酰葡萄糖胺β-1,3-半乳糖基转移酶活性、N-乙酰乳糖胺β-1,3-N-乙酰葡糖胺转移酶活性和聚N-乙酰乳糖胺生物合成过程;京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路主要富集在鞘糖脂生物合成-珠蛋白和等珠蛋白系列、鞘糖脂生物合成-乳酸和新乳酸系列和白细胞介素(IL)-17信号通路。参白解毒方可明显抑制FOSB和B3GALT5等参与富集的关键基因的表达(P<0.05),且具有浓度依赖性。结论:糖脂代谢可能是结直肠腺瘤湿热蕴结证的生物学基础,参白解毒方可能通过下调FOSB和B3GALT5的表达抑制结直肠癌的发生。

参白解毒方基于Wnt/β-catenin信号通路对结直肠癌细胞增殖和迁移的抑制作用

目的:研究参白解毒方对结直肠癌细胞增殖和迁移的药效及其作用机制。方法:用参白解毒方处理人结直肠癌细胞HT29、SW480和SW620,MTT和平板克隆形成实验检测细胞的增殖和自我更新能力;细胞划痕实验检测HT29细胞的迁移能力;实时定量PCR或Western Blot检测上皮-间充质转化(EMT)相关标记物(E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin)、Wnt5a和β-catenin的表达水平;实时定量PCR检测Wnt/β-catenin信号通路下游的结直肠癌肿瘤干细胞标志物CD44和CD133的表达水平。结果:参白解毒方可抑制结直肠癌细胞HT29、SW480和SW620的增殖(P<0.01,P<0.05),减少HT29细胞形成克隆的数目(P<0.05,P<0.01);细胞划痕实验结果表明参白解毒方可以显著抑制HT29细胞的迁移(P<0.05,P<0.01),且具有剂量依赖性。实时定量PCR和Western Blot结果显示,参白解毒方可以剂量和时间依赖性的上调上皮细胞标志物E-Cadherin mRNA和蛋白的表达,下调间质细胞标志物N-Cadherin、Vimentin mRNA和蛋白的表达;参白解毒方同时可以下调Wnt5a、β-catenin mRNA和蛋白的表达,抑制Wnt/β-catenin信号通路活化,显著抑制结直肠癌肿瘤干细胞标志物CD44、CD133的mRNA表达。结论:参白解毒方可以抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移,其作用机制可能与调控Wnt/β-catenin信号通路从而逆转结直肠癌细胞EMT的发生,降低结直肠癌细胞干性相关。

α-常春藤皂苷调控SNX10介导的谷氨酰胺代谢抑制肠上皮细胞恶性转化研究

目的 研究干扰分选连接蛋白10(sorting nexin 10,SNX10)表达对人正常肠上皮FHC、NCM460细胞增殖、谷氨酰胺代谢的影响及α-常春藤皂苷调控作用的分子机制。方法 利用转染技术构建稳定敲低SNX10的FHC、NCM460细胞,qRT-PCR和Western blotting检测敲低效率;CCK-8、克隆形成实验检测细胞增殖能力;MTT筛选α-常春藤皂苷实验浓度并检测其对SNX10表达的影响;检测细胞内还原型谷胱甘肽含量;Western blotting检测细胞SNX10、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,m TORC1)/c-myc信号通路相关蛋白及下游谷氨酰胺转运蛋白SLC7A5表达情况。结果 敲低SNX10后FHC、NCM460细胞增殖异常加快(P<0.01),细胞内还原型谷胱甘肽含量异常升高(P<0.01),m TORC1/c-myc通路被激活,下游SLC7A5表达升高;而α-常春藤皂苷干预SNX10敲低细胞系后,细胞SNX10表达升高(P<0.05、0.01),且上述变化发生逆转并渐趋空载细胞水平。结论 SNX10有望成为结直肠癌临床诊断及防治的新靶点,α-常春藤皂苷可逆转肠上皮细胞因SNX10敲低导致的快速增殖、m TORC1/c-myc信号通路活化及谷氨酰胺代谢的异常升高,从而抑制正常肠上皮细胞的恶性转化。

参白解毒方通过调控PTEN/PI3K/Akt信号通路抑制结直肠癌细胞增殖

目的:研究参白解毒方基于磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)/磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路抑制结直肠癌细胞HCT116增殖的作用机制。方法:采用水提醇沉法提取参白解毒方有效部位进行冻干粉制备;体外培养HCT116细胞,用参白解毒方(2、4、8、16 g·L^(-1))对HCT116细胞进行处理,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测参白解毒方对HCT116细胞增殖的抑制作用;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测细胞PTEN、PI3K、Akt、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、c-核蛋白类基因(c-Myc)、生存素(Survivin)和细胞周期蛋白D1(CyclinD1)mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PTEN、磷酸化磷酸酶及张力蛋白同源物(p-PTEN)、PI3K、Akt、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、GSK-3β、磷酸化糖原合成酶激酶-3(p-GSK-3β)、c-Myc、Survivin、CyclinD1的蛋白表达水平;免疫荧光检测β-连环蛋白(β-catenin)入核情况。结果:与空白组比较,参白解毒方各质量浓度均可以显著抑制HCT116细胞的增殖(P<0.01),且具有浓度依赖性。与空白组比较,参白解毒方处理细胞后PTEN、GSK-3βmRNA表达水平均上调,PI3K、Akt、c-Myc、Survivin、CyclinD1 mRNA表达水平均下调(P<0.01);细胞PTEN、p-PTEN和GSK-3β蛋白表达水平上调,PI3K、Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β、c-Myc、Survivin、CyclinD1蛋白表达水平均下调(P<0.05,P<0.01)。免疫荧光结果显示参白解毒方可以抑制结直肠癌细胞HCT116中β-catenin的入核。结论:参白解毒方可以抑制结直肠癌细胞HCT116的增殖,其作用机制可能是通过调节PTEN/PI3K/Akt信号通路。

缺氧微环境下仙连解毒方抑制结直肠癌细胞增殖的作用及机制

目的:观察缺氧微环境下仙连解毒方对含溴结构域蛋白4(Brd4)诱导的核转录因子-κB(NF-κB)信号通路激活的影响,探讨其抑制结直肠癌细胞HT-29增殖的作用机制。方法:于缺氧培养箱或常氧培养箱中培养人结直肠癌细胞HT-29,给予仙连解毒方(0.8、1、1.2、1.6、3.2、6.4、12.8 g·L^(-1))干预细胞48 h,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力;采用线粒体膜电位荧光探针(JC-1)检测仙连解毒方(1.25、2.5、5 g·L^(-1))对细胞线粒体膜电位的影响,采用流式细胞术检测结直肠癌细胞HT-29凋亡情况;细胞克隆形成实验及5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EDU)法检测结直肠癌细胞HT-29细胞增殖能力;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Brd4及其下游蛋白如c-核蛋白类基因(c-Myc)、六亚甲基双乙酰胺诱导蛋白1(HEXIM1)的表达水平,同时检测仙连解毒方对NF-κB信号通路相关蛋白的影响。结果:与空白组比较,仙连解毒方(0.8、1、1.2、1.6、3.2、6.4、12.8 g·L^(-1))组均能抑制结直肠癌细胞HT-29细胞活力(P<0.05,P<0.01),且缺氧培养下细胞半数抑制浓度(IC_(50))>常氧培养组。与空白组比较,仙连解毒方(1.25、2.5、5 g·L^(-1))组细胞线粒体膜电位明显下降、细胞凋亡增多(P<0.05,P<0.01)。与空白组比较,仙连解毒方(1.25、2.5、5 g·L^(-1))组细胞克隆数减少,EDU阳性细胞数减少(P<0.05,P<0.01)。Western blot结果示,与空白组比较,仙连解毒方(1.25、2.5、5 g·L^(-1))组细胞内Brd4、c-Myc蛋白表达量均有不同程度的下降,HEXIM1表达升高(P<0.05,P<0.01);磷酸化(p)-NF-κB p65、磷酸化NF-κB抑制蛋白α(p-IκBα)蛋白表达下调(P<0.05,P<0.01)。结论:缺氧微环境下仙连解毒方可抑制Brd4调控的结直肠癌细胞HT-29增殖,抑制NF-κB信号通路的激活可能是其机制之一。

参白解毒方抑制HCT116细胞增殖的药效及机制

目的:探讨参白解毒方(SBJDF)抑制结直肠癌(CRC)细胞HCT116增殖的药效及机制。方法:利用参白解毒方(0、0.25、0.5、1、2、4 g·L^(-1))处理HCT116细胞48 h,噻唑蓝(MTT)比色法检测参白解毒方对HCT116细胞活力的影响,分别设置空白组、参白解毒方(1、2、4 g·L^(-1))组,倒置显微镜观察参白解毒方对HCT116细胞形态的影响,克隆形成实验观察参白解毒方对HCT116细胞增殖能力的影响,JC-1探针检测参白解毒方对HCT116细胞线粒体膜电位(Δψm)的影响,流式细胞仪检测HCT116细胞周期分布和细胞凋亡率,蛋白免疫印迹法(Western blot)分析参白解毒方对细胞周期,抗凋亡以及核转录因子-κB(NF-κB)信号通路相关蛋白的影响。结果:参白解毒方有效抑制HCT116细胞活力,引起细胞形态改变,呈浓度依赖性;与空白组比较,参白解毒方(1、2、4 g·L^(-1))组克隆形成率均明显下降(P<0.05,P<0.01),参白解毒方(2、4 g·L^(-1))组诱导HCT116细胞发生G0/G1期阻滞(P<0.05,P<0.01)。与空白组比较,参白解毒方(1、2、4 g·L^(-1))组周期蛋白D(1 CyclinD1)表达明显下降(P<0.05,P<0.01),参白解毒方(2、4 g·L^(-1))组细胞周期蛋白A(2 CyclinA2),周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)蛋白表达明显下降(P<0.05,P<0.01),参白解毒方(4 g·L^(-1))组周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)表达显著下降(P<0.01)。与空白组比较,参白解毒方(2、4 g·L^(-1))组课诱导HCT116细胞凋亡,并下调抗凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关xl蛋白(Bcl-xl)表达(P<0.05,P<0.01),降低HCT116细胞线粒体膜电位;与空白组比较,参白解毒方(2、4 g·L^(-1))组可下调NF-κB信号通路相关蛋白IκB激酶α(IKKα)、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)、磷酸化p65蛋白(p-p65)的表达(P<0.05,P<0.01)。结论:参白解毒方有效抑制HCT116细胞增殖,其机制可能通过抑制HCT116细胞NF-κB信号通路的激活,引起细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡。

仙连解毒方抑制结肠癌肝转移的作用及机制

目的:探讨仙连解毒方通过影响肿瘤相关巨噬细胞的分布抑制结直肠癌肝转移的作用及机制。方法:BALB/c小鼠通过脾脏注射结直肠癌细胞的方法建立脾脏肝转移模型,按体质量随机分组,连续给药21 d后处死小鼠,剥取小鼠肝脏组织,观察结直肠肿瘤肝转移情况。HE染色观察组织病理形态学变化;流式细胞仪检测小鼠外周血及腹腔灌洗液内F4/80~+CD11b~+肿瘤相关巨噬细胞分布情况;Western blot检测肝组织内JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3及MMP2、MMP9蛋白表达水平,免疫组化检测肝转移灶内F4/80~+巨噬细胞分布及MMP9蛋白表达。结果:与模型组比较,仙连解毒方具有显著抑制结直肠癌肝转移的作用(P<0.01),降低肿瘤相关巨噬细胞在外周血及腹腔的分布,减少肝转移灶内巨噬细胞的浸润,显著性降低肝转移灶内p-JAK2/AK2、p-STAT3/STAT3蛋白比值(P<0.01);同时显著性抑制MMP2、MMP9蛋白在肝转移灶内的表达(P<0.01)。结论:仙连解毒方具有显著抑制结直肠癌转移的作用,其机制可能与抑制JAK2-STAT3通路,下调MMP2、MMP9,减少肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞的浸润相关。

仙连解毒方对结直肠癌湿热瘀毒证模型小鼠肠道细胞类型的影响

目的采用单细胞转录组测序技术探讨仙连解毒方治疗结直肠癌湿热瘀毒证的作用机制。方法30只雄性C57BL/6N小鼠随机分为对照组、模型组、仙连解毒方组,每组10只。模型组和仙连解毒方组小鼠采用高脂饮食与氧化偶氮甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导建立结直肠癌湿热瘀毒证模型,对照组给予正常饮食。3个循环的DSS饮水结束后,仙连解毒方组开始给予仙连解毒方12.9 g/kg灌胃,对照组及模型组给予等体积的生理盐水,每天1次,连续灌胃6天后停1天,连续给药16周。末次给药结束4 h后,取各组小鼠结直肠组织,HE染色观察小鼠结直肠的组织病理形态。取距肛门6 cm的远端结肠段2 cm,解离组织样本,分离单细胞悬液,提取RNA行qPCR扩增,进行单细胞转录组测序。采用CellRanger-v5.0.0进行数据质控,Seurat-v3.1.1软件包进行降维聚类分析、细胞类型鉴定,对差异基因行GO和KEGG富集分析。结果HE染色结果显示,空白组小鼠结肠腺体排列规则,细胞核位于基底部,呈扁平或立方状;模型组上皮细胞极性消失,呈巢状、筛孔状,中央见坏死,细胞核浆比增大,核染色深,核仁明显,核分裂现象显著;仙连解毒方组上述情况得到明显改善。单细胞转录组测序共捕获3组小鼠肠道细胞45480个,降维聚类将所有细胞归为20个细胞群,鉴定各细胞群标记基因,分析得出小鼠肠道细胞主要包括9种细胞类型:肠上皮细胞、B细胞、自然杀伤T细胞、天然淋巴细胞、干细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、成纤维细胞。仙连解毒方组较模型组小鼠肠道组织中肠上皮细胞占比上升,B细胞、自然杀伤T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞占比下降。GO与KEGG富集分析显示,仙连解毒方对结直肠癌湿热瘀毒证的作用主要富集在免疫系统进程、抗原处理和呈递、适应性免疫反应、转运ATP合酶活性旋转机制等方面,信号通路主要涉及免疫系统信号、癌症相关通路、细胞增殖与死亡信号、能量代谢信号等。结论仙连解毒方调控结直肠癌湿热瘀毒证模型小鼠肠道组织中免疫细胞比例,抑制上皮细胞间质转化,可能是其治疗结直肠癌湿热瘀毒证的作用机制。

仙连解毒方对人结直肠癌细胞增殖及糖酵解的调控作用及机制

目的:观察仙连解毒方对人结直肠癌细胞HCT-116增殖及糖酵解的影响,并探讨其潜在的分子机制。方法:采用噻唑蓝(MTT)比色法测定仙连解毒方处理结直肠癌细胞HCT-116后的存活率,细胞克隆形成实验和5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EDU)细胞增殖实验检测细胞增殖能力,葡萄糖试剂盒检测仙连解毒方处理结直肠癌HCT-116细胞48 h葡萄糖摄取量的变化,乳酸试剂盒检测仙连解毒方处理结直肠癌HCT-116细胞48 h乳酸生成量的变化,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、雷帕霉素靶蛋白(m TOR)、葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)、乳酸脱氢酶(LDHA)等糖酵解相关蛋白的表达,探讨仙连解毒方对结直肠癌糖酵解过程的影响。结果:仙连解毒方对结直肠癌HCT-116细胞的半数抑制浓度(IC;)为6.82 g·L^(-1);克隆形成实验和EDU细胞增殖实验表明,与空白组比较,仙连解毒方(1.625、3.25、6.50 g·L^(-1))均能明显抑制结直肠癌HCT-116细胞增殖(P<0.05,P<0.01);葡萄糖检测和乳酸检测表明,与空白组比较,仙连解毒方(1.625、3.25、6.50 g·L^(-1))能有效抑制葡萄糖摄取和乳酸生成(P<0.05,P<0.01),且有剂量依赖性;Western blot表明,与空白组比较,仙连解毒方(1.625、3.25、6.50 g·L^(-1))均能下调p-m TOR/m TOR、LDHA、GLUT1蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01),且随剂量的增加而降低。结论:仙连解毒方对结直肠癌细胞的增殖和糖酵解中的瓦博格效应(Warburg)具有明显的抑制作用,其机制可能与调控mTOR信号通路,下调LDHA、GLUT1等糖酵解过程中的关键蛋白和酶类的表达水平有关。

仙连解毒方对结直肠癌原位瘤小鼠肿瘤增殖的抑制作用及机制探讨

目的:探讨仙连解毒方对结直肠癌(CRC)原位瘤小鼠肿瘤的抑瘤作用,并对其作用机制进行探讨。方法:建立CT26原位瘤小鼠模型,按体质量随机分为正常组、模型组、5-FU给药组、仙连解毒方给药组,连续给药28 d,隔日观察小鼠状态。处死小鼠后剥取瘤组织,HE染色观察组织病理形态学变化;免疫组织化学染色法检测小鼠瘤组织增殖细胞核抗原(PCNA)表达;TUNEL染色观察仙连解毒方对原位肿瘤细胞凋亡的影响;Western Blot检测原位瘤组织内糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、p-GSK-3β、β-连环蛋白(β-catenin)蛋白表达的变化。结果:与模型组比较,仙连解毒方可以显著减少原位瘤的体积(P<0.01),HE及TUNEL染色结果显示仙连解毒方使肿瘤组织凋亡及坏死细胞增加;免疫组织化学染色结果显示,仙连解毒方给药组小鼠瘤组织内PCNA的蛋白表达减少。Western Blot染色结果显示,仙连解毒方给药后小鼠瘤组织内p-GSK-3β/GSK-3β比值显著下降(P<0.01),β-catenin蛋白表达显著下调(P<0.01)。结论:仙连解毒方具有抑制小鼠CRC原位瘤增殖的作用,其作用机制与干预Wnt/β-catenin通路,抑制肿瘤细胞的增殖、促进肿瘤细胞凋亡有关。

仙连解毒方干预“湿热瘀毒证”小鼠结直肠肿瘤的转录组学分析

目的:通过转录组测序技术(RNA-seq)分析仙连解毒方干预"湿热瘀毒证"小鼠结直肠肿瘤的转录组学特征。方法:将90只C57BL/6(雄性)小鼠随机分为正常组、"湿热瘀毒证"结直肠肿瘤模型组及仙连解毒方组,每组30只。模型组和仙连解毒方组予以高脂饲料喂养,以经典氧化偶氮甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸钠(DSS)方式构建结直肠癌模型,仙连解毒方组从造模当天开始给药(12.9 g·kg^(-1)),共给药112 d。末次给药结束4 h后,取各组小鼠结直肠组织,苏木素-伊红(HE)染色和亚甲基蓝染色观察小鼠结直肠的组织病理形态;提取结直肠组织总RNA,采用RNA-seq技术进行转录组学测序,进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析,并筛选、验证差异基因。结果:与模型组比较,仙连解毒方可显著改善小鼠结直肠充血水肿情况,减少小鼠结直肠肿瘤数量、体积;亚甲基蓝染色结果表明仙连解毒方可以显著抑制畸形隐窝灶(ACF)的发生(P<0.01);HE染色显示仙连解毒方可显著减轻结直肠组织的损伤、异型增生;RNA-seq测序结果显示,模型组与正常组差异表达的基因共615个,上调基因446个,下调基因169个。仙连解毒方组与模型组差异表达的基因共54个,上调基因29个,下调基因25个。RNA-seq测序分析发现仙连解毒方主要调控NIMA相关蛋白激酶7(Nek7,P<0.01),黏蛋白16(Muc16,P<0.01),Siah E3泛素蛋白连接酶家族成员3(Siah3,P<0.01),胰岛再生基因3g(Reg3g,P<0.01),RNA聚合酶2延长因子相关因子2(Eaf2,P<0.01),转化生长因子-α(TGF-α,P<0.05),分泌珠蛋白家族1A成员1(Scgb1a1,P<0.05),序列相似家族227成员B(Fam227B,P<0.05),细胞色素P450家族2亚家族c多肽40(Cyp2c40,P<0.01),锚蛋白重复及EF手结构域蛋白1(Ankef1,P<0.05)等基因的表达,并且肠上皮细胞增殖等生物过程、细胞色素P450酶对外源性药物的代谢作用,花生四烯酸代谢等信号通路被显著富集。结论:仙连解毒方具有干预"湿热瘀毒证"小鼠结直肠肿瘤发生、发展的作用,转录组学分析提示可能与干预代谢相关通路密切相关。