以培养从业人员为导向的实验动物学课程改革与实践——以华南农业大学为例

为提高实验动物学教学质量,增加课程趣味性和实用性,本文以华南农业大学为例,结合农业院校的特点,系统分析了实验动物学课程改革的重要性,提出了以培养从业人员为导向的实验动物学课程改革方向,归纳了具体的改革内容、方式、评价手段及实施效果,以期培养具备理论知识和实操能力的学生,建立良好的教育环境,在为农业院校科研做好支撑的同时,为学生提供新的就业方向。

硫氧还蛋白对过氧化氢诱导的BRL-3A细胞损伤的保护作用

本试验利用不同浓度过氧化氢(H2O2)作用于BRL-3A大鼠肝细胞,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测BRL-3A细胞存活数量以确定H2O2最适损伤浓度。试验随机分为正常对照组、H2O2处理组和硫氧还蛋白(2.5和5μmol/L)预处理组,用脂质过氧化物丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)试剂盒测定细胞的氧化应激变化。结果显示1000μmol/L H2O2对BRL-3A细胞增殖具有显著的抑制作用(P<0.05);2.5μmol/L硫氧还蛋白对H2O2损伤的BRL-3A细胞具有保护作用,能显著抑制H2O2诱导的BRL-3A细胞损伤产生MDA(P<0.05),并显著增加细胞SOD及CAT的活性(P<0.05),从而保护肝细胞。本试验结果表明,硫氧还蛋白对H2O2诱导BRL-3A细胞的氧化应激损伤具有保护作用。

伪狂犬病病毒Ra株对不同细胞增殖特性及致病性研究

本研究以伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)Ra株体外感染不同的细胞系为模型,研究PRV Ra株最适细胞系。试验采用ST细胞、PK-15细胞、Vero细胞、F81细胞、DF1细胞、MDCK细胞和CEF细胞7种细胞作为该毒株的接种对象,观察毒株在这几种细胞上病变特点、细胞病变时间及病毒增殖规律等并进行比较。观察结果发现,受试的各种细胞在PRV感染期间均能表现明显的细胞病变,但不同细胞在病变时间上存在较大差异,其中PK-15和ST细胞在感染后24h内出现明显细胞病变,时间最早。TCID50测定病毒增殖力结果表明,ST细胞在病毒增殖传代中毒力保持最好,与原毒株毒力相当,为106.9 TCID50/0.1mL。本试验结果表明,ST细胞是较适合于PRV Ra株体外研究的细胞系。

肉鸡Trx1和Trx2蛋白的表达纯化及其抗氧化应激效果评价

试验旨在对肉鸡Trx1和Trx2蛋白进行表达和纯化,并评价其抗氧化特性。将原核表达载体GgTrx1-pET28a(+)和GgTrx2-nsp-pET28a(+)转入大肠埃希菌中进行蛋白表达;应用镍柱亲和层析的方法对该融合蛋白进行纯化;采用胰岛素还原法对重组肉鸡Trx1和Trx2蛋白(GgTrx1和GgTrx2)进行活性鉴定;通过细胞体外试验分析比较GgTrx1和GgTrx2对大鼠肝细胞BRL-3A氧化应激保护作用的影响。结果显示,试验成功获得两种重组蛋白:GgTrx1和GgTrx2,最适诱导条件分别为37℃、0.4mmol/L IPTG诱导4h和37℃、1.0mmol/L IPTG诱导4h;纯化的重组蛋白GgTrx1和GgTrx2纯度可达到90%,浓度分别达到4.0和5.0 mg/mL。重组蛋白GgTrx1和GgTrx2均具有较高的还原胰岛素二硫键的能力,并呈现出浓度效应。体外细胞试验发现,重组蛋白GgTrx1和GgTrx2均能显著降低过氧化氢诱导的BRL-3A膜脂过氧化,保护抗氧化酶SOD和CAT活性,且重组蛋白GgTrx2效果更明显。本试验结果表明,重组蛋白GgTrx1和GgTrx2均具有生物学活性和良好的抗氧化应激特性,且线粒体型Trx2为临床治疗氧化应激性疾病提供了更多可能。

一例犬股骨骨折的手术治疗

通过询问病史、术前检查、X线检查等方法对1只3月龄阿拉斯加幼犬股骨骨折进行诊断,并采用髓内针结合钢丝内固定手术进行治疗,术后经输液、抗感染等综合治疗调养,犬只病情得到明显改善,1个月后基本可以正常行走。

不同硒浓度日粮对小鼠肝脏和睾丸组织中部分硒蛋白mRNA水平的影响

选取80只7周龄雄性BALB/c小鼠,随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组,每组20只,使Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组基础日粮中硒含量达到0.045、0.1、0.4和0.8mg/kg。结果表明:①Ⅰ组能显著降低小鼠肝脏中硒的沉积量(P<0.05);②Ⅰ组谷胱甘肽过氧化物酶1(glutathione peroxidase 1,GPx1)的mRNA相对表达量明显低于Ⅱ、Ⅲ组(P<0.05),且Ⅱ、Ⅲ组在肝脏中差异显著(P<0.05),在睾丸中差异不显著(P>0.05);③Ⅰ、Ⅲ组肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPx4)的mRNA相对表达量差异不显著(P>0.05),但均显著低于Ⅱ组(P<0.05),而各试验组间在睾丸中差异均不显著(P>0.05);④随着日粮中硒添加量的增加,肝脏和睾丸中硫氧还蛋白还原酶2(thioredoxin reductase 2,TrxR2)的mRNA相对表达量显著提高(P<0.05)。因此,在肝脏和睾丸组织中,饲喂低硒饲料能显著降低硒的沉积量和GPx1、GPx4、TrxR2的mRNA相对表达量(P<0.05);而饲喂高硒饲料能显著降低GPx1的mRNA相对表达量(P<0.05),同时显著增加TrxR2的mRNA相对表达量(P<0.05)。提示,硒对GPx1、GPx4和TrxR2mRNA相对表达量的调节存在组织差异性。

日粮硒对小鼠肾脏硒沉积及抗氧化酶基因表达的影响

本试验旨在研究日粮硒对小鼠肾脏硒沉积及抗氧化酶基因表达的影响。试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别以0.045、0.1、0.4和0.8mg/kg含硒量的试验日粮连续饲喂小鼠8周。结果显示,肾脏硒沉积水平随日粮中硒含量增加而升高,Ⅰ组显著低于其他组(P<0.05),饲喂到第56天,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组组间差异均不显著(P>0.05);Ⅰ组的硫氧还蛋白还原酶2(TrxR2)mRNA表达量显著低于Ⅱ、Ⅲ组(P<0.05),Ⅱ组高于Ⅲ组,且差异显著(P<0.05);Ⅰ组的超氧化物歧化酶1(SOD1)和超氧化物歧化酶2(SOD2)mRNA表达量均显著低于Ⅱ、Ⅲ组(P<0.05),Ⅱ、Ⅲ组间SOD1表达量差异不显著(P>0.05),SOD2表达量差异显著(P<0.05),且Ⅱ组高于Ⅲ组;Ⅰ、Ⅱ组的过氧化氢酶(CAT)mRNA表达量显著高于Ⅲ组(P<0.05),但Ⅰ、Ⅱ组间差异不显著(P>0.05)。结果表明,补硒可提高肾脏组织硒沉积水平,且随着饲喂时间增加,肾脏硒沉积会在高硒添加组中趋于饱和;缺硒和补硒过量都会降低肾脏TrxR2、SOD1、SOD2和CAT mRNA的表达水平。

动物离心机控制系统仿真设计

针对当前动物离心机的局限性,对动物离心机控制系统进行了设计,用于航空航天医学实验。对动物离心机设备主轴控制系统进行设计研究,利用空间矢量调制搭建出动物离心机主轴电机位置、速度、转矩控制的三闭环主轴控制系统,在MATLAB/Simulink环境下,建立对主轴控制系统的仿真模型。仿真结果表明采用交流伺服控制系统能够实现动物离心机主轴的良好控制,并通过运行调试验证了主轴控制系统设计的可行性,且具有一定应用价值。

利巴韦林对猫细小病毒感染诱导F81猫肾细胞中凋亡相关基因表达的影响

试验将F81猫肾细胞随机分为对照组、药物组(猫细小病毒(FPV)+利巴韦林)、病毒组(FPV感染),采用实时荧光定量PCR的方法,检测Bcl-2、Bcl-xl、Bax和Caspase 3等凋亡相关基因的相对表达量。结果显示,与对照组相比,病毒组细胞凋亡增加,抗凋亡基因Bcl-2mRNA表达受到抑制,Bax mRNA和Caspase 3mRNA的相对表达量均有不同程度的上调。药物组细胞的抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl的表达水平显著高于病毒组(P<0.05),且总体呈上调状态,但72h时Bcl-xl表达量减少;而药物组的促凋亡基因Bax和Caspase 3的表达量显著低于病毒组(P<0.05),48h前,Bax的表达量呈递减状态,72h时检测结果显示药物组Bax表达量相比对照组显著上调(P<0.05),但仍显著低于病毒组(P<0.05);与对照组相比,病毒组和药物组Caspase 3的表达量在72h时显著上调(P<0.05)。综上所述,利巴韦林可在基因水平通过上调抗凋亡基因Bcl-2和Bcl-xl和下调促凋亡基因Bax和Caspase 3的表达来抑制FPV感染诱导的F81猫肾细胞凋亡发生。

浅谈狂犬病的流行及现状

近年来随着人们生活水平的提高,许多人开始养起了犬猫等各类小动物作为宠物,在饲养过程中难免会发生抓咬的情况,因此,狂犬病在人们口中不再是专业名词,但是坊间流传的信息大多不太科学,很多时候会造成不必要的恐慌。将狂犬病的流行及现状向群众做一个普及是很有必要的事情。

广州地区犬细小病毒VP2基因的序列分析

犬细小病毒病是一种高度接触性传染病,临床上以急性出血性肠炎和心肌炎为特征。为研究广州地区犬细小病毒病的流行亚型,本试验采集2011—2012年间疑似病犬粪便,进行犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)分离鉴定,提取病毒基因组进行VP2基因扩增和序列分析,与GenBank中登录的参考毒株进行比对,结果发现,分离的8株CPV中SCAU-5为CPV-2b亚型,其余为CPV-2a亚型。结果表明,2011—2012年间广州地区的流行毒株以CPV-2a亚型为主。

高铜诱导大鼠心肌细胞线粒体自噬

旨在探讨高铜对大鼠心肌细胞线粒体自噬的影响。将32只8月龄健康大鼠随机分为4组,每组8只,饲喂不同铜含量日粮(对照组:15 mg·kg-1;高铜Ⅰ组:30 mg·kg-1;高铜Ⅱ组:60 mg·kg-1;高铜Ⅲ组:120 mg·kg-1),连续饲喂6个月后采集心。检测心组织铜含量及其病理变化;荧光定量检测线粒体自噬相关基因LC3A、LC3B、Parkin、PINK1、p62的mRNA水平;蛋白印迹检测Parkin、PINK1、LC3B/LC3A的蛋白表达水平;免疫组化和免疫荧光检测LC3B的定位及表达。结果显示,高铜各组大鼠心组织内的铜含量均高于对照组。高铜各组出现心肌纤维排列疏松、无规则的现象。与对照组相比,高铜各组LC3A、LC3B mRNA表达量增加;高铜Ⅱ组、高铜Ⅲ组p62的mRNA表达量极显著降低;高铜各组PINK1 mRNA表达量显著升高,而Parkin mRNA的表达量有上升趋势但不显著。随着日粮中铜含量的增加,PINK1、Parkin、LC3B/LC3A的蛋白的表达量显著上调。LC3B定位于细胞质中,且高铜Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组LC3B表达量均显著增加。试验结果表明,高铜可诱导大鼠心肌细胞线粒体自噬的发生。

长期高铜暴露通过影响线粒体自噬和细胞焦亡诱导大鼠肝组织损伤

旨在探索高铜对大鼠肝组织损伤的作用机制。试验选取120只SD大鼠随机分为对照组、高铜I组、高铜Ⅱ组、高铜Ⅲ组和高铜Ⅳ组,分别连续每天按体重灌胃0、20、40、80、160 mg·kg^(-1)铜63 d,采集肝组织。使用ICP-MS测定肝组织铜含量,病理切片观察肝组织病理变化,透射电镜观察线粒体形态和线粒体自噬小体,RT-qPCR和Western blot检测肝组织NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18、Pink1、Parkin、LCB3、p62的mRNA和蛋白表达水平。结果显示,随着灌胃铜水平的增加,蓄积在肝组织中的铜含量呈剂量依赖性增加,且长期高水平铜暴露会造成明显的肝组织结构破坏;随着铜暴露水平的增加,线粒体自噬和细胞焦亡水平呈先上升后下降趋势;与对照组相比,高铜Ⅱ组、Ⅲ组中PINK1和LC3II/LC3I的mRNA和蛋白表达水平显著上升(P<0.05),高铜Ⅱ组中p62的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05),高铜Ⅲ组NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β的mRNA和蛋白表达水平显著上升(P<0.05),高铜Ⅳ组表现为下调。高铜长期暴露可通过影响线粒体自噬和细胞焦亡诱导大鼠肝组织损伤。

酪酸菌对小鼠有害气体排放的影响

目的探讨酪酸菌对小鼠有害气体排放的影响。方法 80只KM小鼠分4组,每组20只,雌雄各半,Ⅰ组为对照组,Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组分别连续21 d灌胃酪酸菌500 mg/kg、1 000 mg/kg、1 500 mg/kg,每日测定独立通气笼内氨(NH_3)和硫化氢(H_2S)浓度,试验21 d测定各组小鼠生长性能、小鼠粪便中脲酶活性。结果与对照组相比,Ⅲ组、Ⅳ组小鼠的平均日增重略有提高,但没有统计学差异;灌胃后7 d,Ⅲ组、Ⅳ组笼内NH3含量明显低于Ⅰ组和Ⅱ组(P<0.05),各组均未检测到H_2S。结论酪酸菌可能会影响小鼠的生长性能和氨的排放。

“两岸家庭”的“两岸咖啡”

优雅浪漫的钢琴声，温馨舒适的环境，铁板烧与日本怀石料理特有的。香味……，走进杭州西湖岸旁“两岸咖啡”店内，心情不自觉地就会放松下来，眼前的小桥流水，江南的庭园香榭，让人有种梦幻感觉。

MC38结肠癌小鼠肿瘤浸润免疫细胞的动态变化

目的观察荷瘤小鼠肿瘤浸润免疫细胞在肿瘤发展过程中的动态变化。方法将小鼠结肠癌MC38细胞移植到24只C57BL/6J小鼠皮下,荷瘤后每周一次记录小鼠体质量及肿瘤大小的变化,每周一次采用流式细胞术检测肿瘤浸润免疫细胞水平,包括CD45^(+)细胞、CD3^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞、CD4^(+)T细胞、自然杀伤(natural killer,NK)细胞、树突状细胞、巨噬细胞、M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞、髓源抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)、单核样髓源抑制细胞(monocytic-MDSC,M-MDSC)、粒样髓源抑制细胞(granulocytic-MDSC,M-MDSC),共检测4周。结果随着小鼠结肠癌肿瘤的增长,CD45^(+)细胞水平总体表现出下降趋势,CD8^(+)T细胞水平稳步下降至不可逆的水平,而CD4^(+)T细胞比例在荷瘤早期迅速增长,单位体积中浸润细胞数增长了近8倍,肿瘤浸润的T细胞几乎为CD4^(+)表型。以NK细胞为代表的非特异性免疫应答水平持续下降,而树突状细胞在肿瘤内持续累积,并通过激活精氨酸酶1(Arginase-1,ARG1)和诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthetase,iNOS),进一步加深免疫抑制作用。巨噬细胞浸润水平整体无显著变化,但Ⅰ型巨噬细胞浸润细胞数的下滑速度显著高于Ⅱ型。单位体积肿瘤内MDSC数未出现下降趋势,在肿瘤内持续累积;其中G-MDSC浸润水平呈稳降趋势,M-MDSC浸润水平持续上升,且占比远高于G-MDSC。结论小鼠移植MC38结肠癌细胞后,肿瘤组织内免疫细胞浸润水平整体下降,促肿瘤免疫逐渐占据主导地位,从而促进结肠癌的发展。肿瘤内产生了Th1/Th2漂移现象,特异性和非特异性免疫应答水平均显著降低,浸润的单核细胞和粒细胞主要是Ly6C^(+)表型。肿瘤相关树突状细胞和巨噬细胞发挥了重要的免疫抑制作用,CD4^(+)T细胞和M-MDSC可能是发挥促肿瘤免疫效应的关键点。

糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化的研究

目的:研究糖尿病模型大鼠造模后不同时间段骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)的成骨及成脂分化能力的改变,探讨糖尿病模型骨质疏松形成与BMSCs成骨及成脂分化能力的相关性。方法:利用链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)加高糖高脂饲料诱导制作大鼠糖尿病模型,正常大鼠作为对照组。分别于注射STZ液4、8、12周后,利用全骨髓贴壁法来扩增和纯化BMSCs,取生长良好的第3代细胞作为本实验的研究对象。用成骨诱导液诱导细胞分化,培养7 d后,检测碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, ALP)活力,14 d后,进行茜素红染色及检测ALP和骨钙素(Osteocalcin, OC) mRNA含量。用成脂诱导液诱导细胞分化,诱导14 d后,进行油红O染色,计算脂肪细胞转化率;进行油红O染色定量分析;检测脂蛋白脂酶(Lipoprotein Lipase, LPL)和过氧化物酶增殖活化受体(Peroxisome Proliferator Activated Receptor, PPARγ2) mRNA含量。结果:注射STZ液8、12周后,糖尿病组ALP活力明显下降,与对照组比较,P <0.01。对照组钙化结节数量明显多于糖尿病组。ALP基因相对OD值,糖尿病组(0.26 ±177;0.05)低于对照组(0.42 ±177;0.09),P <0.01。OC基因相对OD值,糖尿病组(0.31 ±177;0.09)低于对照组(0.41 ±177;0.06),P <0.05。注射STZ液4、8、12周后,油红O染色,对照组、糖尿病组镜下观察可见有红色脂滴,对照组脂肪细胞转化率(25.16 ±177;5.03)明显低于糖尿病组(66.85 ±177;10.01),P <0.01。油红O染色定量分析结果(OD值),对照组(0.016 ±177;0.015)油红含量明显低于糖尿病组(0.058 ±177;0.016),P <0.01。LPL基因相对OD值,糖尿病组(0.89 ±177;0.05)高于对照组(0.22 ±177;0.05),P <0.01。PPARγ2基因相对OD值,糖尿病组(0.38 ±177;0.03)高于对照组(0.18 ±177;0.01),P <0.01。结论:注射STZ液4周以后,糖尿病大鼠BMSCs成脂分化能力增强;8周以后,成骨分化能力明显下降,可能与骨质疏松的形成有一定的关系。

链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞体外培养观察及其增殖能力检测

目的:研究糖尿病模型大鼠不同时间段体外培养条件下骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的增殖能力的改变,初步探讨糖尿病模型骨质疏松形成与BMSCs生物学特性改变的相关性。方法:利用链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)加高糖高脂饲料诱导制作大鼠糖尿病模型,正常大鼠作为对照组。分别于注射STZ液4、8、12周后,体外利用全骨髓贴壁法来扩增和纯化BMSCs,取生长良好的第3代细胞作为本实验的研究对象。流式细胞仪检测细胞表面标志物CD34、CD29的表达。采用 Cell Count kit-8 (CCK-8)分别绘制细胞的生长曲线来评价增殖能力。结果:培养的细胞CD29表达为阳性,CD34表达为阴性。注射STZ液4、8、12周后,来源于糖尿病大鼠的BMSCs的增殖均较正常的大鼠显著性减慢(P 0.05。结论:糖尿病大鼠来源的BMSCs可以成功地在体外进行增殖培养,但是随着时间的增加,其在增殖能力生物学性状上有不同程度的损害。糖尿病大鼠BMSCs 的增殖影响可能具有一定的时间依赖性,可能与骨质疏松的形成有一定的关系。

H9N2亚型AIV不同攻毒方式排毒规律的研究

为了研究H9N2亚型禽流感目前的流行情况,从广东省某鸡场的发病鸡中分离到一株H9N2亚型禽流感病毒(A/Chicken/Guangdong/1104/2014),遗传进化分析显示该毒株属于BJ/94-like谱系h9.4.2.5分支,与经典疫苗株的HA基因相似性为89.3~90.7%,通过点眼滴鼻、静脉注射、肌肉注射的方式攻毒SPF鸡研究其攻毒后的排毒规律。结果表明:病毒通过点眼滴鼻和静脉注射方式攻毒能够很好地感染SPF鸡,并在攻毒后第3天排毒率达到100%,但是随后几天排毒率逐渐下降,点眼滴鼻组在攻毒后第7天排毒率下降为0;肌肉注射组则没能有效感染SPF鸡,攻毒后第3~9天的排毒率为16.7%~33.3%。说明静脉注射是较好的攻毒方式,能有效感染SPF鸡,SPF鸡攻毒后第3~5天的排毒率达到100%。

猪亚硝酸盐中毒模型复制与诊疗

为探讨猪亚硝酸盐中毒发生的剂量及发展机制,以24头健康仔猪为试验动物,随机分为4组,每组6个重复。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组分别用5%亚硝酸钠按体重50,70,90 mg/kg灌胃,复制猪亚硝酸盐中毒模型,Ⅳ组为对照组,用等量生理盐水灌胃,对仔猪亚硝盐中毒的发生时间及仔猪的体温、心率、呼吸等情况进行监测及记录,并取发病猪的呕吐物或胃内容物及血液进行了亚硝酸盐检验和变性血红蛋白检验。结果表明:Ⅰ组仔猪亚硝酸盐中毒行为发生在灌胃后1.5 h内,Ⅱ组和Ⅲ组仔猪均在灌胃后15~20 min内突然发病;Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组仔猪出现中毒反应后呼吸和心率明显比Ⅳ组快(P<0.05),体温比Ⅳ组低(P>0.05);亚硝酸盐检验试验中Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组均显示滤纸棕色,变性血红蛋白检验中Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组均显示血液褪色反应,且Ⅱ组和Ⅲ组褪色比Ⅰ组更明显(P<0.05),Ⅳ组血液保持鲜红。说明50 mg/kg的亚硝酸钠可导致仔猪明显的亚硝酸盐中毒,70 mg/kg的亚硝酸钠可导致仔猪急性死亡。