抗人胱抑素C单克隆抗体制备及免疫检测体系建立

目的获得人胱抑素C(cystatin C,CysC)重组蛋白,制备亲和力高、特异性强的单克隆抗体,建立检测人血清中CysC的竞争ELISA检测体系。方法根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)CysC基因序列优化合成CysC基因片段,并在大肠杆菌中表达得到CysC重组蛋白,免疫Balb/c小鼠后,通过杂交瘤细胞融合技术筛选获得阳性杂交瘤细胞株,制备腹水型单抗并进行纯化,通过间接ELISA法检测抗体的亲和力等性质,建立竞争ELISA检测体系,并对52个血清样本进行检测。结果获得了4株稳定分泌CysC单克隆抗体的细胞株,将抗体Ab3作为检测抗体并进行辣根过氧化物酶标记,其亲和力为4.26×10~6L/mol,检测线性范围为0.011~1.924μg/mL,检测限为4.598 ng/mL,半数抑制率(IC_(50))为0.145μg/mL。建立的竞争ELISA血清检测体系能准确检测52个血清样本。结论获得了亲和力、特异性较高的单克隆抗体,建立了可靠的竞争ELISA血清检测体系,为CysC快速免疫检测试剂盒的研制奠定了基础。

高效检测人降钙素原化学发光免疫分析方法的建立与评价

目的重组原核表达人降钙素原(PCT)蛋白,制备抗人PCT单克隆抗体,建立高效检测PCT化学发光免疫分析方法。方法根据NCBI提供的PCT基因序列,按照大肠埃希菌偏爱密码子优化后进行全基因合成,通过BamHⅠ和XhoⅠ双酶切将其构建到pET32a载体上;将pET32a-PCT质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3),用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用Western blot法分析重组蛋白表达情况;用镍亲和纯化柱纯化重组蛋白,以此为抗原免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合,采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法进行克隆化后再用间接ELISA法筛选阳性单克隆细胞;将阳性单克隆细胞接种于小鼠腹腔内,制备腹水单抗,经Protein A/G纯化后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,采用间接ELISA方法对抗体的特异性、灵敏度以及亲和力进行鉴定;用NaIO4氧化HRP法标记单克隆抗体,通过棋盘法筛选配对单克隆抗体,以筛选的配对抗体为捕捉抗体,建立双抗夹心化学发光免疫分析的血清学检测体系,检测临床150例血清标本,其中PCT升高(>0.05ng/ml)120例,PCT阴性(<0.05ng/ml)30例。结果共筛选出6株抗人PCT蛋白的单克隆细胞,制备的腹水效价均大于4×10^(-6);通过棋盘法筛选得到2对能够进行双抗夹心配对的单抗,其中1对亲和力较高,其亲和力常数分别为2.39×10~8 L/mol和2.91×10~8 L/mol。双抗夹心化学发光免疫分析方法检测线性范围为0.06~8ng/ml,其中阳性检出率为96.6%,阴性符合率为100%,与临床检测数据相比,相关系数R^2=0.9737。结论建立的双抗夹心ELISA方法灵敏度高、特异性强、稳定可靠,可用于细菌、寄生虫等病原体感染患者的PCT血清学定量检测。