鸡传染性贫血病毒衣壳蛋白的原核表达及鉴定

[目的]用大肠杆菌表达出CIAV的衣壳蛋白(VP1)作为免疫抗原,以建立鸡传染性贫血病毒(CIAV)的血清学诊断方法。[方法]根据已发表的CIAV的衣壳蛋白(VP1)序列,结合Protean软件预测出抗原富集区域,设计并合成1对引物,利用PCR扩增该区域基因,将扩增成功的VP1基因片段经T4连接酶连接至PGEX-6P-1表达载体。连接成功的重组质粒转化不同的大肠杆菌表达菌株,通过IPTG诱导进行原核表达,筛选出表达量最高的菌株及最佳诱导时间和IPTG诱导浓度。以感染CIAV的鸡阳性血清为一抗,对重组蛋白GST-VP1进行Western-blot分析。[结果]成功获得了重组质粒PGEX-VP1,诱导表达后经SDS-PAGE和Western-blot分析,分子量约71k D的融合蛋白GST-VP1在大肠杆菌Rosseta中以包涵体形式大量表达,并能与鸡传染性贫血病毒阳性血清发生反应。[结论]该研究可为抗CIAV单克隆抗体的制备及血清学诊断方法的建立等研究奠定基础。

环介导等温扩增技术及其在动物疫病检测中的应用

环介导等温扩增(LAMP)是一门新兴的分子生物学检测技术,因其具有高特异性、高灵敏度、简便快捷、成本低廉等特点,受到越来越多兽医工作者的关注。目前,该方法已经广泛应用于各种病原微生物的检测。本文就环介导等温扩增技术的原理、方法、应用等方面进行简述,最后指出LAMP当前存在的一些不足之处,并对其发展前景进行了展望,以期为其临床应用提供理论依据。

定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒游离受体夹心ELISA方法的建立与应用

为了建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)游离受体定量检测方法,本试验用表达猪唾液酸黏附素(Sn)游离受体的重组腺病毒rAd-Sn4D-Fc感染PK-15细胞,以细胞培养上清纯化的Sn4D-Fc游离受体作为标准抗原,鼠抗猪Sn免疫血清为一抗,生物素标记兔抗猪Sn多克隆抗体为二抗,建立定量检测Sn4D-Fc游离受体的双抗体夹心ELISA方法;用rAd-Sn4D-Fc注射仔猪,定期采集血清进行游离受体检测。结果显示,纯化Sn4D-Fc标准抗原的纯度为94.3%,能被Sn免疫血清识别;一抗的最佳工作浓度为5μg/mL蛋白,二抗的最佳稀释度为1∶4 000,夹心ELISA检测标准抗原的灵敏度为0.4ng/mL,对照抗原无交叉反应;夹心ELISA能从重组腺病毒注射猪血清中检测到Sn4D-Fc游离受体,最高表达量为6.54ng/mL,持续时间为15d。研究结果表明,建立的双抗体夹心ELISA可用于PRRSV游离受体的体内外定量检测。

复合微生态制剂对蛋鸡生产性能、肠道黏膜形态、肠道有害菌、粪便含水率和氮排泄的影响

试验在基础饲粮中添加由丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和粪肠球菌组成的复合微生态制剂,研究其对蛋鸡的生产性能、肠道黏膜形态、肠道有害菌、粪便含水率和氮排泄的影响。选用150日龄的健康状况良好且体重相近的海兰褐商品蛋鸡6 000只,随机分成2组。对照组蛋鸡饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮中添加0.05%的复合微生态制剂。试验期90 d。结果表明:(1)与对照组相比,饲粮添加复合微生态制剂蛋鸡的产蛋率提高6.76%,死淘率降低5.33%,料蛋比也有一定程度的降低。(2)与对照组相比,试验组蛋鸡粪便含水率下降1.36%,粗蛋白含量下降3.95%,氮排泄率降低3.95%。(3)饲粮中添加微生态制剂改善了十二指肠和空肠黏膜形态,十二指肠绒隐比提高7.00%,空肠绒隐比提高8.79%。(4)与试验第0天相比,试验90 d检测蛋鸡肠道内容物,大肠菌群检出率降低了42.85%。(5)与对照组相比,试验组因细菌性腹泻死淘的蛋鸡数占蛋鸡总死淘数比例降低了56.17%。研究表明,饲粮中添加复合微生态制剂能够显著提高蛋鸡的产蛋性能、改善肠道健康,提高饲料利用率,降低氮的排泄量,抑制大肠杆菌的增殖,继而减少蛋鸡细菌性腹泻的发病率。

模式生物的研究

理想的研究材料以及模式生物是实验成功的关键因素之一,如果可以选择良好的模式生物对于烦琐的实验起到可以事半功倍的效果,所以对于现在高度发达的生物学研究来说选择一个有很强针对性的模式生物是非常关键的。

反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)快速检测基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒

为建立一种基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的快速检测方法,根据其ORF6基因保守序列设计了3对特异性引物,通过引物筛选及条件优化,建立了基因2型PRRSV的反转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided isothermal amplification,RT-RAA)快速检测方法。结果显示:该方法在40℃恒温孵育25 min即可完成靶序列扩增;特异性强,和猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒均无交叉反应;灵敏度高,最低检出限为2×10^(0)TCID_(50)/μL,是常规RT-PCR方法的10倍;应用该方法对39份疑似PRRSV感染的临床样品进行检测,检出阳性样品25份,和实验室前期建立的荧光定量RT-PCR方法检测结果一致。以上结果说明,本研究建立的RT-RAA检测方法简便快速、特异性强、灵敏度高、临床适用性好,为PRRSV感染的快速诊断提供了新的技术手段。

圈养环境下黑帽悬猴行为时间分配和活动节律

2017年4月在南京红山森林动物园,采用瞬时扫描取样法观察5只黑帽悬猴(Cebus apella)的行为,分析不同性别、年龄组的日行为时间分配和活动节律。结果表明,圈养黑帽悬猴的主要行为活动为休息(52. 06±1. 03)%、移动(23. 22±0. 58)%、取食(14. 65±0. 69)%、理毛(4. 98±0. 35)%等。雄猴和雌猴的休息、玩耍、乞食和刻板行为所占时间比例差异显著。相比于成年黑帽悬猴,幼猴玩耍的时间更长(χ~2=13. 643,P <0. 05),乞食行为所占时间更多(χ~2=4. 057,P <0. 05)。雄猴取食时间先于雌猴和幼猴,在上午和下午投食后均优先取食。周末游客人数比平日显著增加,雌猴和幼猴乞食行为也显著增多,其波动节律具有一致性。针对圈养黑帽悬猴行为管理提出了一些丰容措施和游客管理建议。

盐城地区八个蛋鸡场鸡滑液囊支原体病流行病学调查

了解盐城地区蛋鸡鸡群滑液囊支原体病的流行状况,为科学制定综合防控措施提供参考,笔者采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)和酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)对盐城市8个蛋鸡养殖场(4个疑似发病场和4个项目试验场)鸡群进行鸡滑液囊支原体检测。结果显示:咽喉拭子的病原学检测阳性率为7.50%(34份/455份),鸡只血清样品的血清学阳性率为13.54%(52份/384份)。调查结果表明,盐城部分地区蛋鸡场存在鸡滑液囊支原体感染,需要采取有效措施来控制其传播。

荧光定量RT-PCR检测高致病性PRRSV接触感染仔猪增殖动态

为检测高致病性PRRSV接触感染仔猪的增殖动态,建立了荧光定量RT-PCR方法,该方法在模板为2.18×10~1~2.18×10~6拷贝范围内具有良好线性关系,相关系数为0.996,灵敏度比常规RT-PCR高1 000倍,并且与其他猪病病毒无交叉反应;在3头健康仔猪中引入1头PRRSV人工感染猪,定期监测仔猪接触感染PRRSV后病毒血症和排毒水平,研究结果表明,接触感染猪后分别于3、5 d首次在血清和粪便中检出PRRSV,相比人工接种猪推迟2 d,此后7 d内病毒含量迅速上升并维持较高水平直至死亡。本研究为PRRSV在猪体内的定量检测提供了有效手段,为进一步了解PRRSV的传播机制以及建立防治PRRSV感染的仔猪模型提供了基础数据。

一株鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及药敏实验

为了有效防治鸭疫里默氏杆菌病,本研究对送检的疑似病料进行鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatidis,RA)PCR检测,将阳性病料进行细菌分离培养,通过革兰染色、生化实验及PCR验证进行鉴定,并对该分离株进行药敏实验。结果显示,脑、脾、肝病料RA阳性,分离株鉴定为RA,命名为YCSY1,该分离株对环丙沙星等7种抗生素表现为耐药,对头孢唑啉和多西环素中度敏感,对青霉素、氧氟沙星和氨苄西林高度敏感。

基于重组酶介导等温扩增技术的鸡滑液囊支原体检测方法建立和初步应用

为建立一种鸡滑液囊支原体(MS)快速简便的检测方法,研究根据MS vlhA基因保守序列设计3对引物,通过引物筛选和条件优化,建立了基于重组酶介导等温扩增技术(RAA)的MS检测方法,并对其特异性和灵敏度进行评估。应用该方法对68份鸡咽喉拭子临床样品进行检测,并和农业行业标准中的PCR方法进行对比。结果显示:该方法最佳引物为vlhA F3/vlhA R3,在38℃孵育25 min即可完成靶基因扩增,并且特异性强,与鸡毒支原体(MG)、禽多杀性巴氏杆菌、鸡沙门菌、鸡大肠杆菌、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒(AIBV)、鸡传染性法氏囊病病毒等其他鸡病病原体无交叉反应;灵敏度高,对MS基因组DNA的最低检出限度为15.5 pg;应用该方法从68份临床样品中检出阳性样品29份,与PCR方法检测结果一致。研究表明,建立的RAA方法快速简便,不依赖昂贵的仪器设备,有望用于基层实验室或MS的临床快速诊断。

盐城滨海鸭源大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析

本研究采集盐城滨海地区临床疑似大肠杆菌病的病死鸭病料,通过分离培养、革兰氏染色镜检、PCR实验,分离鉴定出3株鸭大肠杆菌。对分离菌进行药敏试验发现,3株大肠杆菌对氯霉素、红霉素、青霉素均耐受;对氨苄西林、环丙沙星和复方新诺明为2株耐受,1株敏感;诺氟沙星最为敏感,2株高敏,1株中敏;其次为丁胺卡那和庆大霉素,1株高敏,2株中敏;复方新诺明2株耐药,1株高度敏感。

鸡滑液囊支原体PCR检测方法的建立与初步应用

针对鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviea,MS)vlhA基因序列设计特异性引物,建立MS PCR检测方法。该方法能够从MS阳性菌株DNA模板中扩增出预期大小(488 bp)目的条带,而其他鸡病病原体扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,检出的MS DNA最低质量浓度为2.25×10^(-2) ng/μL;应用该方法对某蛋鸡场MS疑似病例的咽喉拭子进行检测,阳性率为53.8%(7/13)。本研究为MS的早期确诊及防控提供了重要参考依据。

不同消毒剂及频率对蛋鸡场水线消毒效果观察

随着集约化养殖规模的不断扩大,饮水管理已成为蛋鸡场饲养管理的重要环节之一。据调查,盐城地区多数蛋鸡场水线容易受到细菌的污染,导致病原微生物滋生,发病率提高。为解决该问题,本试验一方面选择可清除生物膜消毒剂用于水线的浸泡消毒,探讨消毒剂对水线浸泡消毒的效果;另一方面选择2种可添加到饮水中不同有效成分的消毒剂(三氯异氰脲酸粉和过硫酸氢钾复合物粉),分别从消毒剂种类和消毒频率两个角度探讨水线消毒效果。

蛋鸡饥饿法强制换羽技术的研究与应用实践

本文讨论了蛋鸡饥饿法强制换羽的准备、步骤和换羽鸡群的管理三个方面研究制定了蛋鸡强制换羽技术,并在本地部分蛋鸡场广泛应用。结合本地两个蛋鸡场应用实践,蛋鸡饥饿法强制换羽可解决产蛋后期蛋鸡生产性能低下等问题,在降低生产成本,减少市场行情不好带来的负面影响发挥着积极作用,得到广大养殖户的青睐。

重组禽流感(H5+H7)三价灭活苗免疫蛋鸡抗体消长规律研究

本试验选择400羽77日龄蛋鸡作为试验鸡,接种重组禽流感病毒三价灭活苗,分析蛋鸡体内的H5、H7亚型禽流感免疫抗体消长规律,为制定合理的蛋鸡免疫程序和免疫计划提供参考。

盐城地区部分规模蛋鸡场饮水微生物控制现状与检测

本文以盐城地区11家规模蛋鸡场为研究对象,于2020年11月至2021年3月期间,开展了饮水水质的微生物学控制现状与检测。检测结果表明,用自来水作为水源水的水质合格率高于深井水作为水源水的水质;水源的微生物指标合格率高于水线水,水线污染较为严重。通过开展三氯异氰脲酸粉和过硫酸氢钾复合物粉二种消毒剂对水线水质的杀菌效果试验,以期为广大蛋鸡养殖户提供饮水微生物控制对策,提高饮水水质。

蓝孔雀群发支原体病的诊断与治疗

2015年11月下旬,南京红山森林动物园饲养繁育基地群养蓝孔雀出现咳嗽、张口呼吸、发出气管啰音、甩头等临床症状,发病后期极度消瘦,最终死亡。对死亡蓝孔雀进行剖检,初步怀疑为呼吸道疾病感染,随后通过病原体分离鉴定得以确诊为支原体感染。药敏试验结果显示该支原体对泰乐菌素、替米考星、诺氟沙星均敏感。经过4个月的用药与治疗,患病蓝孔雀死亡率逐渐下降,病情得到有效控制。

圈养白颊长臂猿的采血训练

对白颊长臂猿的采血训练,一方面是方便兽医对白颊长臂猿健康状况的检查,了解长臂猿在放松无刺激环境下的常规和生化值,为动物的饲养和繁殖作出针对性的指导。另一方面可增强长臂猿与人的信任感,减少动物的刻板行为,丰富长臂猿日常生活,提高动物福利。于2015-2017年陆续对5只长臂猿成功进行采血训练,发现训练效果与动物年龄大小、个体性格差异、训练环境以及动物疾病的治疗干预等多种因素有关。

环介导等温扩增技术的研究进展

环介导等温扩增(LAMP)技术是一门新兴的分子生物学检测技术,因其具有高特异性、高灵敏度、简便快捷、成本低等特点,受到越来越多兽医工作者的关注。目前,该方法已被广泛应用于各种病原微生物的检测。文章对LAMP技术的原理、方法、应用等方面进行了简单论述,最后指出LAMP技术目前还存在一些不足,并对其发展前景进行了展望。