不同比例TNBS诱导Balb/c小鼠克罗恩病模型的建立及评价

目的不同三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS)比例诱导Balb/c小鼠克罗恩病(Crohn disease,CD)模型的建立及评价。方法以完全随机区组化的方法将32只Balb/c小鼠分为4组,按水∶无水乙醇∶TNBS比值分为模型1组(2∶5∶3)、模型2组(1∶5∶4)及模型3组(0∶5∶5),每组8只。另8只健康小鼠作为对照组,以小鼠一般情况、体质量变化、结肠长度变化、粪便性状、结肠组织病理学评分等为指标评价不同比例TNBS诱导的小鼠CD模型进展并计算小鼠生存率。于建模后第7天取材进行结肠组织病理学检查及组织病理评分,取小鼠血清检测炎性细胞因子IL-6水平,同时测量小鼠结肠长度。结果模型3组小鼠生存率低,整个实验周期体质量持续下降,建模第3天即出现严重腹泻、便血等症状,7天后结肠长度显著缩短(P<0.001),组织损伤严重,组织病理学评分及IL-6水平均显著升高(P<0.001);模型1组小鼠第3天情况与模型3组相似,体质量在第3、4天显著下降(P<0.05)后有所回升,第7天镜下检查结肠组织损伤及炎症情况轻,结肠长度并无显著缩短;模型2组小鼠体质量、结肠长度及IL-6水平变化情况与模型3组相似,炎性细胞浸润及结肠局部损伤有大量炎性细胞浸润。结论模型2组(体积比1∶5∶4)小鼠生存率高,炎症轻重程度适中,病理变化情况稳定,是一种CD研究较好的模型制备方法。

利用CRISPR/Cas 9技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统及其初步应用

旨在利用CRISPR/Cas 9新型基因编辑技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统,并分析其对不同大肠杆菌aroA基因敲除、修复的差异。首先构建靶向aroA基因的CRISPR/Cas 9载体;随后人工设计同源修复供体基因序列,并亚克隆到CRISPR/Cas 9载体中,构建成完整的CRISPR/Cas 9基因敲除体系;将该系统分别应用到大肠杆菌DH10B、DH5α和JM109细胞中,PCR鉴定筛选到的阳性菌株,并回收其扩增条带进行克隆、测序。CRISPR/Cas 9载体的酶切与测序结果均正确,表明载体构建成功;PCR鉴定结果显示,该系统对三种大肠杆菌均能进行aroA基因的有效敲除,敲除效率为46%~58%;测序结果进一步证实目的基因敲除成功。本试验成功构建大肠杆菌aroA基因CRISPR/Cas 9敲除系统,为进一步研究致病菌aroA基因功能及开发减毒大肠杆菌疫苗提供新型、有效的基因敲除工具。

番鸭呼肠孤病毒σNS蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为制备番鸭呼肠孤病毒(MDRV)YB株σNS蛋白的多克隆抗体,首先经RT-PCR扩增了σNS基因的完整编码序列,并成功构建了重组表达质粒pET-YB-σNS。将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示成功高效表达出分子质量约为58ku的融合蛋白。该融合蛋白以包涵体和可溶性蛋白两种形式存在,表达时的最佳诱导时间、IPTG诱导浓度、诱导温度分别为4h、1mmol/L和37℃。通过对包涵体和可溶性蛋白进行尿素洗涤纯化和(或)Ni 2+柱亲和层析纯化,得到了高纯度的重组蛋白。分别对纯化前、后的重组蛋白进行Western-blot分析,结果显示两者均可以与MDRV阳性血清发生特异性反应,表明它们具备良好的反应原性。将纯化后的可溶性σNS蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体ELISA效价达1∶32 000。上述研究结果为后续MDRVσNS蛋白功能研究奠定了基础。

番鸭呼肠孤病毒σNS基因真核表达载体的构建及其在DF-1细胞中的表达

为实现番鸭呼肠孤病毒（MDRV）YB株σNS蛋白的真核表达,首先经PCR扩增了σNS基因的完整编码序列（CDS）,连接到携带有flag标签的真核表达载体pCI-neo-flag,双酶切鉴定及序列测定表明成功构建了重组表达质粒pCI-flag-σNS,使用ViaFect转染试剂将其转染至DF-1细胞,采用半定量RT-PCR法检测σNS基因的转录水平,Western-blot分析σNS蛋白的表达。RT-PCR结果显示,σNSmRNA水平在转染后0~36h逐渐递增,48h时出现下降;Western-blot鉴定结果显示,重组σNS蛋白与flag鼠单克隆抗体和MDRV-σNS兔多克隆抗体均能发生特异性反应;以上结果均表明MDRV-YBσNS基因在DF-1细胞中得到了正确的表达,为后续蛋白功能研究奠定了基础。

禽白血病重组毒FJ15TH0株不同感染方式对SPF鸡感染状态及组织病毒载量的影响

为揭示禽白血病病毒(ALV)自然重组毒FJ15TH0感染SPF鸡群的不同方式对其感染状态和病毒组织分布的影响,本研究设计动物试验分别模拟垂直传播和生长早中期水平传播,动态检测各组病毒血症、泄殖腔排毒、抗体反应及不同内脏组织病毒载量,为制定地方鸡群中ALV感染的防控和净化措施提供可靠的流行病学依据。结果表明胚内接种模拟垂直传播组除2只实验鸡外均产生免疫耐受,持续带毒排毒而无抗体产生;1日龄和D组均未表现泄殖腔排毒,在接触病毒后2~3w后C组63.6%实验动物表现一过性病毒血症,D组未表现病毒血症,暴露后5~11w期间C组9.1%~25%鸡出现一过性血清抗体,D组在暴露后3~5w期间14.3%~42.8%实验鸡产生一过性血清抗体。11w时剖杀实验鸡,荧光定量RT-PCR检测各组各实验鸡不同组织的gp85mRNA及病毒粒子的基因组RNA含量,结果显示垂直感染组表现泄殖腔排毒者gp85检测均为阳性,该分离株对肾脏和法氏囊的组织亲嗜性最强,而对肝脏和脾脏的亲嗜性较低;而同居感染组实验鸡均表现为gp85mRNA检测阴性,表明该重组毒水平感染能力较弱。