高质量发展视域下医院临床研究体系的建设探索与思考

探索上海市某专科医院临床研究管理体系的建设情况,以提升医院临床研究管理水平。总结国内临床研究管理体系建设存在的主要问题,并提出建设策略。探索并提出临床研究科研平台建设、临床研究管理团队培养、临床研究管理支撑体系构建的方案和策略。临床研究体系的建设增加了高质量临床研究成果的产出,进一步推动了医院高质量发展。

神经突起生长导向因子(netrin)受体家族研究进展

神经突起生长导向因子netrin是一种分泌蛋白 ,在神经发育所需的轴突导向及细胞迁移中发挥双重导向功能———吸引或排斥 ,主要依赖于生长锥所表达的不同受体结肠癌缺失蛋白 (DCC)或UNC5同源物 (UNC5H) ,从而传递不同信息。同时 ,dcc和unc5h也是肿瘤抑制基因 ,近年来的研究显示这种双重导向功能可能归因于它们属于配体依赖性受体家族。依赖性受体的重要特征是缺乏相应配体时将诱导细胞凋亡 ,因此推测DCC和UNC5H不仅为神经元传递信号所必需 ,同时也是细胞生存因子 ,与细胞存活及正常功能的发挥密切相关。

TNF-α诱导肝干细胞凋亡及信号转导途径的改变

目的:研究肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导肝干细胞(WB细胞)凋亡及其信号转导机制.方法:WB细胞经TNF-α诱导不同时间,用流式细胞术(FCS)检测细胞凋亡及细胞周期改变;用核酸提取及电泳技术检测细胞DNA的变化;经Western blot检测TNF-α诱导WB细胞与凋亡有关分子的改变.结果:TNF-α诱导WB细胞24h,FCS发现51%细胞凋亡,核酸电泳出现DNA"ladder"现象;同时与细胞凋亡相关的转录因子NF-κB核内转移,活化的凋亡蛋白酶caspase-3增多,而与细胞增殖相关的信号转导途径被阻断-磷酸化的Erk/Akt水平下调.结论:经TNF-α诱导,与凋亡相关的信号分子caspases-3被激活,而与细胞增殖有关的信号途径被阻断(p-Erk/Akt)下调,导致细胞可能发生增殖阻滞而凋亡.

转基因小鼠在生命科学中的研究进展

基因工程技术的飞速发展,使得利用转基因小鼠动物模型从生物整体上研究基因组的功能得以实现,并且其应用领域越来越广泛。将与疾病相关目的基因插入到与人类基因组高度同源的小鼠基因序列中构建转基因小鼠模型为研究人类疾病的分子机制提供了强有力的工具。传统的转基因技术由于技术受限影响其应用。近年来,新的转基因小鼠技术,如靶向转基因、快速定点转基因技术的应用为生命科学研究提供了更好的平台,将促进其进一步发展。

专科医院肿瘤生物样本库资源管理信息平台

通过总结专科医院生物样本库信息化管理现况,梳理关键问题和短板,以便针对性优化整合胸部肿瘤生物样本库资源管理信息平台,真正实现生物样本的巨大使用价值及相关延伸价值,促进临床科研资源被合理、充分利用。

优化病理生理学实验课教学方法 提高教学质量

病理生理学是基础医学教育的一门主干课程，是联系基础与临床的桥梁，实践性很强。实验研究是病理生理学研究和发展的主要手段和动力。在病理生理学教学中，实验课占有重要地位，是提高病理生理学教学质量不容忽视的一部分。因此，优化病理生理学实验课教学方法，提高学生的积极性、主动性，增强实验课教学效果，加强学生能力培养，对提高病理生理学教学质量具有至关重要的作用。

利用原代培养神经元研究netrin-4的受体定位

目的利用体外原代培养神经元,研究神经突起诱向因子netrin-4的受体,分析netrin-1已知受体DCC和UNC5H1作为netrin-4受体的可能性。方法改良Koh法培养出生12 h内Wistar乳鼠神经元,免疫细胞化学鉴定纯度;以碱性磷酸酶(AP)标记的netrin-4为配体,以神经元及转染DCC和UNC5H1的COS7细胞为对象,亲和细胞化学法检测netrin-4的受体;RT-PCR法分析神经元中netrin-4、DCC和UNC5H1的表达。结果成熟神经元胞核大,突起长,交织成网;以抗神经丝蛋白(NF)抗体行免疫细胞化学鉴定,纯度较高;转染DCC和UNC5H1的COS7能与AP4-netrin-4结合,定位在细胞膜上。结论建立起稳定的原代神经元培养法,并研究神经突起诱向因子受体的定位。DCC和UNC5H1可能是netrin-1与netrin-4的共受体。

乳鼠嗅球及皮层神经元的原代培养和Netrin-4受体在神经元定位的初步研究

目的 培养原代嗅球及皮层神经元细胞 ,研究神经轴突生长诱向因子 (Netrin 4 )受体在神经元细胞中的定位。方法 改良Koh法分离、培养出生 12h内Wistar乳鼠的嗅球及皮层神经元 ,采用免疫细胞化学方法鉴定其纯度。碱性磷酸酶 (AP)标记的Netrin 4融合蛋白与原代培养第 7d的神经元孵育 ,以亲和细胞化学法检测Netrin 4受体在神经元的定位。结果 原代培养第 7d的嗅球及皮层神经元胞体饱满 ,突起长并交织成网状 ;免疫细胞化学染色见神经丝蛋白(neurofilament)在神经元胞体及突起中表达 ;嗅球及皮层神经元的细胞膜上均有Netrin 4受体表达。结论 建立起高效、稳定的原代神经元培养方法并应用于神经突起生长诱向因子受体的定位研究。

医学机能学实验教学实践与体会

近年来为适应素质教育改革的需要,很多高等医学院校相继开设了一门新型学科——机能学实验,这门以实验为主导的新兴课程已突破了传统的验证性实验的框架,以培养学生的创新识和多方面综合能力为宗旨。这一新的教学目标对教师提出了严峻的挑战。

弹力纤维染色在评估肺癌胸膜侵犯中的意义

目的探讨胸膜弹力纤维(elastic fibers,EFs)染色在肺癌TNM分期应用中的价值。方法随机选取手术切除的肺癌标本200例,肉眼观察癌组织均紧贴胸膜。石蜡切片,行HE及EFs染色。按照WHO(2004)肺癌分类标准,对200例标本进行组织学类型分类、观察并分析HE及EFs染色结果。结果光镜下对200例标本进行组织学分类,其中162例为腺癌、29例为鳞癌、4例为腺鳞癌、5例为大细胞癌;其中肿瘤细胞未突破胸膜弹力层92例,突破胸膜弹力层108例(含破脏层胸膜20例);HE染色28例无法判断或判断不清,最终经EFs染色得出结论。结论应用胸膜EFs染色,能直观地观察肿瘤细胞是否到达或突破胸膜层,有助于准确评估肺癌的胸膜侵犯和TNM分期。

全反式维甲酸抑制Ets-1介导的肝癌7402细胞离散和侵袭及其分子机制

目的 研究全反式维甲酸(ATRA)对Ets介导的实体瘤细胞侵袭转移性的影响及探讨其分子机制,寻找新的抗癌药物作用靶点。方法 采用基因转染的方法,将Ets-1基因高表达在低侵袭转移的肝癌7402细胞中,使其增殖、离散侵袭能力增强,再经ATRA处理细胞,用细胞生物学方法检测细胞增殖性、肝癌细胞离散性及穿透Transwell聚碳酯膜能力的改变。并用Northern杂交、Western印迹等分子生物学手段检测ATRA的分子作用机制。结果 发现ATRA可抑制7402细胞因Ets-1高表达而增强的增殖、离散、侵袭性,可下调Ets、c-Met基因的表达,使MAPK、PI3K信号途径中两个关键分子 Erk/Akt的磷酸化水平降低。结论ATRA可能通过下调Ets基因的表达,进而使c-Met表达水平降低,导致MAPK、PI3K信号转导减弱而抑制肿瘤细胞增殖和侵袭;Ets基因可以作为抗癌药物作用的靶点来筛选药物或进行药理研究。

全反式维甲酸诱导HL60细胞凋亡及相关信号途径的改变

目的 研究全反式维甲酸 (ATRA)诱导早幼粒细胞白血病细胞株 (HL60细胞 )凋亡及其分子机制。方法 HL60细胞经ATRA诱导不同时间 ,用活细胞记数法检测细胞增殖情况 ;用流式细胞术 (FCS)检测HL60细胞凋亡及细胞周期的改变 ;用核酸提取及电泳技术检测细胞DNA分子的变化 ;用透射电镜技术观察了凋亡细胞的结构改变 ;用Westernblot技术检测了ATRA诱导HL60细胞与凋亡有关的分子改变。结果 ATRA诱导HL60细胞第 3天出现细胞增殖抑制且FCS发现细胞出现S期阻滞 ,开始出现凋亡 ,第 5天出现明显的细胞增殖抑制及更高的凋亡比例 ,核酸电泳发现DNA“梯带”现象 ;对照组细胞在透射电镜下核大而圆 ,折光性低 ,染色质均匀 ;而ATRA处理 5d的细胞出现核固缩、染色质浓缩边集及出现凋亡小体。同时细胞内ATRA核受体在诱导第 3天开始表达增加 ,相应地与细胞凋亡相关的酶———半胱氨酸蛋白酶 3(Caspase 3)也表达增加 ,而磷酸化的Erk/STAT水平明显下调。结论 ATRA可以诱导HL60细胞发生凋亡 ,其机制可能为 :ATRA诱导细胞后 ,RAR信号途径被激活 ,导致与凋亡相关的信号途径被激活(Caspase 3表达上调 ) ,而与细胞增殖相关的信号途径被阻断 (p Erk/p STAT水平下降 ) ,引起细胞增殖阻滞 ,发生凋亡。

SHP-2酪氨酸磷酸酶激活突变导致小鼠髓系异常增殖

目的:观察激活突变SHP-2酪氨酸磷酸酶是否参与髓系异常增殖的发生。方法:以野生型(WT)和SHP-2^(D61G/+)突变型C57BL/6小鼠为研究对象,计数外周血白细胞,比较脾大小,流式细胞术检测外周血及骨髓髓系来源细胞表面标志分子(Mac-1、Gr-1),并统计外周血Mac-1和Gr-1阳性细胞率及骨髓细胞中红系(Ter119)、髓系(Mac-1、Gr-1)、T(CD3)、B(B220)淋巴细胞系的阳性细胞率,观察骨髓造血干/祖细胞的集落形成(CFU)能力,Western blotting检测外周血白细胞经白细胞介素3(IL-3)和5μg/L,刺激后磷酸化的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(p-Akt)和磷酸化的细胞外信号调节激酶(p-ERK)表达水平。结果:SHP-2^(D61G/+)突变16周龄组小鼠较WT组外周血白细胞数增多(P<0.05),脾明显增大,同时外周血白细胞的Mac-1和Gr-1阳性细胞率增加(P<0.05),骨髓细胞中Mac-1和Gr-1的阳性细胞率也增多,但红系、淋巴细胞系的变化不明显。同时骨髓中粒-单核细胞集落形成单位(CFU-GM)较正常对照组明显增加,白细胞经IL-3刺激后Akt和ERK蛋白磷酸化水平升高。结论:SHP-2D61G突变可能通过MAPK及PI3K的活化而导致小鼠髓系异常增殖。

用PCR技术从cDNA文库中获取目的基因长片段

目的 建立一种简便有效的获取cDNA大片段的实验技术。方法 应用PCR原理 ,设计特异引物结合文库载体引物对大鼠胎肝cDNA文库进行PCR扩增 ;用随机引物标记法标记已知小片段“目的基因”(30 0bp± )作为探针 ,对PCR产物进行Sorthern杂交以检验“目的基因”片段的正确性及长度 ;回收“目的基因”片段并连接入PGEM T载体 ,转染JM 10 9并扩增后 ,提取“目的基因”测序。结果 琼脂糖凝胶电泳发现PCR扩增产物有多条不同长度的段 ,Sorthern杂交发现一段长度为 1 5kb的cDNA片段为“目的基因” ;测序结果与GeneBank进行Blaste分析 ,该基因为一株新的序列 ,已在GeneBank中登录注册 (RatLiverRegeneration relatedPro tein 1,RLRP 1AF2 36 0 5 4 )。

氧化吲哚类化合物Z24抑制ECV304细胞增殖及迁移的实验研究

目的探讨氧化吲哚类化合物Z24对血管内皮细胞增殖及迁移的抑制作用。方法利用3H-TdR掺入DNA方法来检测Z24对人脐静脉内皮细胞ECV304增殖的影响;扫描电镜方法测定Z24对细胞骨架系统的影响;体外细胞迁移实验测定它对内皮细胞迁移的抑制效应;用免疫沉淀几Western印迹法检测它对ERK信号通路的影响。结果Z24能抑制EGF刺激后ECV304细胞的增殖,能显著抑制ECV304的骨架形成;ECV304的迁移减少;p-ERK水平下调。结论Z24能够抑制血管内皮细胞的增殖和迁移。这种抑制效应可能阻断MAPK信号通路发挥作用的。

SHP-2酪氨酸磷酸酶激活突变促进组织白细胞浸润和器官损伤

目的观察SHP-2D61G/+酪氨酸磷酸酶激活突变对组织白细胞浸润、细胞因子分泌及多器官损伤的影响。方法分别以SHP-2D61G/+激活突变敲入的模型小鼠和野生型C57BL/6小鼠为研究对象,ELISA法检测小鼠血清和白细胞培养上清液中IL-2及TNF-α浓度;采用常规组织切片和HE染色观察心、肺、脾等组织病理学改变;放射免疫法检测血清中丙氨酸转氨酶和心肌肌钙蛋白I的水平。结果 SHP-2D61G/+激活突变小鼠脾、肺组织中白细胞浸润较野生型对照小鼠明显增加,心肌肥大,出现明显炎症损伤型组织学变化;与野生型对照相比,突变小鼠血清及白细胞培养上清液中IL-2和TNF-α浓度均显著增加(P<0.01),血清丙氨酸转氨酶及心肌肌钙蛋白I水平亦显著增高(P<0.01)。结论 SHP-2D61G/+激活突变增强白细胞分泌炎症因子的能力,促进组织白细胞严重浸润和脾、肺、心等多器官损伤,进而导致多器官功能障碍。

Tec酪氨酸蛋白激酶的大鼠组织分布及参与的信号途径

目的：研究Tec在大鼠组织中分布特异性,以及在大鼠肝细胞中Tec可能参与的信号途径．方法：从大鼠心、肝、脾、肺、脑、胸腺和肌肉组织中提取RNA,用Northern blot方法检测Tec在大鼠中的组织分布,在WBF-344细胞中共转染Tec-pSRα真核表达载体与荧光素酶报道基因,再用HGF刺激细胞,用微量发光检测仪检测发光值．结果：Tec在大鼠肝脏与肾脏组织中特异性高表达,在肝干细胞中对HGF介导下的E1k信号分子活化的报告质粒中荧光素酶的表达有明显增强(2-3倍)作用．结论：Tec在大鼠肝脏高表达,Tec可能参与HGF介导Erk途径,可能与肝细胞增殖的信号调控有关．

外泌体和circRNA_101093在抑制肺腺癌铁死亡敏感性中的重要作用

背景与目的铁死亡是一种以铁依赖方式由脂质过氧化物过度积累引起的调节性细胞死亡,近年来发现铁死亡抵抗与肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)发生发展有关。细胞内抗氧化系统是抗铁死亡所必需的。本研究旨在探讨细胞外系统是否以及如何使LUAD细胞对铁死亡失去敏感性。方法在本研究中,使用已建立的人肺成纤维细胞(MRC-5、WI38)、人肺腺癌细胞(H1650、PC9、H1975、H358、A549和H1299细胞系)、LUAD肿瘤及相匹配的癌旁正常组织、健康个体及LUAD患者的血浆,应用免疫组化和免疫印迹方法分析蛋白表达,实时荧光定量PCR(quantitative reverse transcription-PCR,qPCR)法分析mRNA表达。通过测定细胞活力、细胞死亡和脂质活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成评估细胞对铁死亡的反应。通过透射电镜观察外泌体,用点击化学法配合共聚焦显微镜检测花生四烯酸(arachidonic acid,AA)的定位。采用RNA pull down、RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)、光激活核糖核酸苷增强交联和免疫沉淀(photoactivatable ribonucleoside-enhanced crosslinking and immunoprecipitation,CAR-CLIP)等方法检测RNA和蛋白质之间的相互作用。用蛋白质组学方法来分析RNA调控蛋白,用代谢组学方法分析代谢物。细胞源性异种移植物(cell derived xenograft,CDX)模型、患者源性异种移植物(patient-derived xenograft,PDX)模型、细胞植入肺内LUAD小鼠模型和来自LUAD患者的血浆/组织标本被用于分子机制的验证。结果LUAD患者血浆外泌体特异地降低了脂质过氧化,使LUAD细胞对铁死亡敏感性下降。可能的机制是在LUAD中,外泌体circRNA_101093(cir93)中维持了细胞内cir93的升高,调节AA,一种对铁死亡相关的质膜过氧化增加至关重要的多不饱和脂肪酸。对具体机制而言,cir93与脂肪酸结合蛋白3(acid-binding protein 3,FABP3)相互作用增加其表达,后者转运AA并促进其与牛磺酸的反应。因此,总体AA被降低,而N-花生四烯酰基牛磺酸(N-arachidonoyl taurine,NAT;AA和牛磺酸的产物)被诱导产生。值得注意的是,NAT在抑制AA合并到质膜中的作用也被揭示。在临床前的体内模型中,减少外泌体提高了以铁死亡为基础疗法的疗效。结论外泌体和cir93是抑制LUAD细胞铁死亡敏感性的关键,阻断外泌体可能有助于未来LUAD的治疗。

Tec真核表达载体构建及其对细胞信号的影响

目的构建人Tec酪氨酸蛋白激酶真核表达载体;研究Tec参与肝细胞再生的可能信号途径。方法经PCR扩增、酶切、连接等基因重组技术将人Tec插入pCDNA3.1(hismycTec)真核表达载体中,并经酶切、PCR、测序鉴定;用脂质体法将构建的真核表达载体瞬时转染Hela细胞,用Western方法检测Tec蛋白是否表达。用荧光素酶报告基因系统,检测Tec是否参与HGF刺激信号途径的活化。结果构建的Tec真核表达载体使Hela细胞高表达Tec蛋白;并发现Tec在HGF介导下,对Elk信号分子活化的报告质粒中荧光素酶的表达有明显增强作用。结论构建了Tec真核表达载体,并能使HGF介导的MAPK途径活化,提示Tec可能参与HGF介导肝细胞增殖的信号调控。

黏附G蛋白偶联受体GPR110辅助诊断腺泡型和实体型肺腺癌的临床意义

目的 探讨黏附G蛋白偶联受体GPR110的差异表达及其在肺腺癌腺泡型和实体型中的鉴别诊断作用。方法 采用免疫组化、qRT-PCR和ELISA法测定GPR110的表达水平,并分析受试者ROC和曲线下面积(AUC)鉴别肺腺癌的腺泡型和实体型,分析GPR110的差异表达在鉴别诊断两种病理亚型中的作用。结果 GPR110在肺腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织,且其在肺腺癌实体型中的表达明显高于腺泡型。经ELISA法测得100对腺泡型肺腺癌及其癌旁组织的GPR110蛋白平均浓度分别为430.53、313.26 ng/L;53对肺腺癌实体型及其癌旁组织的GPR110蛋白平均浓度分别为716.56、368.46 ng/L,差异均有统计学意义(P<0.001)。同时,ROC曲线通过GPR110蛋白区分肺腺癌腺泡型和实体型的灵敏度为77.36%,特异度为83.00%,最佳Cut-off值为582.27 ng/L,AUC为0.865(0.802~0.927)。结论 GPR110在肺腺癌腺泡型和实体型的鉴别诊断中有潜在的应用价值,有望成为新型鉴别诊断的生物学标志物。