鹿人五毛滴虫巢式PCR检测方法的建立

为了建立鹿人五毛滴虫巢式PCR检测方法并进行验证,根据人五毛滴虫18S r RNA基因的特异性片段设计巢式PCR特异性引物,对两轮PCR反应的退火温度和反应体系中Mg2+浓度进行探索和优化,在此基础上,进一步通过灵敏性和特异性的检测。采用建立的巢式PCR检测方法对68份鹿粪便样品进行检测。结果表明,建立的巢式PCR方法,第一轮PCR最适退火温度为53℃,第二轮PCR最适退火温度为53℃;镁离子浓度为2.5 mmol·L-1。对鹿人五毛滴虫的检测精度可达每毫升10个虫体DNA;对犬贾第虫、阴道毛滴虫、弓形虫、柔嫩艾美尔球虫、大肠杆菌、旋毛虫基因组DNA的扩增的结果均为阴性;68份鹿粪便样品鹿人五毛滴虫的检出率为50%。由此可见,建立的巢式PCR检测方法具有较高的灵敏度和特异性,可用于鹿人五毛滴虫感染的临床检测。

小鼠睾丸组织中转录因子Elk1 cDNA的克隆

为了确定Ets家族转录因子Elk1在睾丸组织中有无表达,提取了正常小鼠睾丸组织的总RNA,经RT-PCR、序列测定证实Elk1在正常小鼠睾丸组织中有表达,为进一步探讨其与睾丸发育及精子发生的关系奠定了基础。

小鼠睾丸组织中转录因子Ets1、Ets2 cDNA的克隆与测序

为了研究转录因子Ets1、Ets2在睾丸组织中有无表达,试验采用Trizol法提取了正常小鼠睾丸组织的总RNA,RT-PCR反应后进行序列测定。结果表明:转录因子Ets1、Ets2在正常小鼠睾丸组织中均有表达。

Caco-2细胞TLR2和TLR4对微小隐孢子虫刺激信号的识别

目的研究Caco-2细胞在微小隐孢子虫感染后TLRs的激活情况。方法微小隐孢子虫子孢子刺激Caco-2细胞后,通过qRT-PCR检测TLRs mRNA的表达水平,采用Western blot检测NF-κB激活情况,采用ELISA检测IL-8的分泌量。同时,在微小隐孢子虫子孢子感染Caco-2细胞前加入TLR2或TLR4的抑制剂,检测NF-κB激活情况以及IL-8的分泌情况。结果将Caco-2细胞感染微小隐孢子虫子孢子2h后,提取的RNA反转成cDNA,采用普通PCR进行检测,结果表明Caco-2能够表达所有10种人TLRs;qRT-PCR检测刺激组与对照组TLRs表达量,经spss分析,p<0.01,刺激组TLR2和TLR4的表达量较对照组显著上调。对Caco-2细胞感染微小隐孢子虫子孢子1h后提取的细胞全蛋白进行Western blot,显示NF-κB激活水平较对照组显著上调;Caco-2细胞感染微小隐孢子虫子孢子12h后收集的细胞培养上清经ELISA检测,IL-8分泌量由刺激前的65.23pg/ml显著上调至488.23pg/ml。而在微小隐孢子虫子孢子感染Caco-2细胞前加入TLR2或TLR4的抑制剂,NF-κB激活水平和IL-8的分泌量较未加抑制剂感染组均显著下调,IL-8的分泌量分别降至204.02pg/ml(抑制TLR2活性后)和142.79pg/ml(抑制TLR4活性后)。结论 Caco-2细胞的TLR2和TLR4参与对微小隐孢子虫子孢子的识别。