miR-181a-5p和BACH2表达对白血病CCRF-CEM细胞凋亡和侵袭的影响

目的:探讨微小RNA-181a-5p(miR-181a-5p)靶向BTB与CNC同源基因2 (BACH2)对急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞凋亡和侵袭的调控作用,并阐明其作用机制。方法:体外构建BACH2过表达重组质粒(overExpBACH2)、miR-181a-5p inhibitor和inhibitor-NC,转染人ALL T淋巴细胞CCRF-CEM,实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法和免疫荧光染色检测转染效果。将CCRF-CEM细胞分为对照组、 inhibitor-NC组、 miR-181a-5pinhibitor组、 BACH2过表达(overExpBACH2)组、 miR-181a-5pinhibitor+空载体(EV)组和miR-181a-5pinhibitor+overExpBACH2组。CCK-8法检测各组细胞增殖活性,流式细胞术检测G_(2)期细胞百分率和细胞凋亡率。Western blotting法检测各组细胞中细胞周期蛋白D3 (CyclinD3)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 (Caspase-3)蛋白表达水平,Transwell小室实验检测各组细胞中侵袭细胞数,RT-qPCR法检测各组细胞中基质金属蛋白酶9 (MMP-9)、基质金属蛋白酶14 (MMP-14)和BACH2 mRNA及miR-181a-5p表达水平。结果:miR-181a-5p inhibitor和overExpBACH2质粒均成功转染CCRF-CEM细胞。与对照组比较,miR-181a-5pinhibitor组、overExpBACH2组、miR-181a-5p inhibitor+EV组和miR-181a-5p inhibitor+overExpBACH2组细胞增殖活性明显降低(P<0.05),G_(2)期细胞百分率和细胞凋亡率明显升高(P<0.05),细胞中CyclinD3蛋白表达水平明显降低(P<0.05),Caspase-3蛋白表达水平和Bax/Bcl-2比值明显升高(P<0.05),侵袭细胞数明显减少(P<0.05),细胞中MMP-9和MMP-14 mRNA及miR-181a-5p表达水平明显降低(P<0.05),BACH2mRNA表达水平明显升高(P<0.05)。与miR-181a-5p inhibitor组和overExpBACH2组比较,miR-181a-5p inhibitor+overExpBACH2组细胞中上述指标变化趋势更明显。结论:miR-181a-5p可靶向BACH2进而调控ALL细胞侵袭和凋亡,为临床靶向治疗ALL提供了新的靶点。

核酸检测中HIV病毒载量对内质控扩增的影响

目的评估酶联免疫法的窗口期HIV血样。方法将酶联免疫法阴性标本采用六混样用2种试剂进行平行核酸检测,在检测出阳性标本后,亦用2种试剂对其拆分进行单管核酸检测。结果 10个月内共筛查16 769例酶联免疫阴性标本中,核酸检测出1例HIV阳性标本,罗氏一代试剂由于该标本病毒载量浓度过高体现出抑制作用,罗氏二代试剂未显示出抑制作用。结论目前现行开展的检测技术仍有安全隐患,为进一步保证临床用血的安全,开展核酸检测可以提高临床用血质量,为临床安全用血提供强有力的保障。

RhoA/Rho激酶信号通路与先天性尿道下裂发生的相关性研究

目的通过构建先天性尿道下裂模型和在体外培养雄性胎鼠尿道海绵体组织来探讨RhoA/Rho激酶信号通路在先天性尿道下裂发生中的作用。方法通过邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯[di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP]灌胃法建立先天性尿道下裂大鼠模型,处死大鼠获得尿道海绵体组织后,免疫组化检测RhoA和p-RhoA蛋白表达,荧光定量PCR(qPCR)检测各组大鼠尿道海绵体组织中RhoA、ROCK1、ROCK2mRNA的表达水平,Western blot检测各组大鼠尿道海绵体组织中RhoA,p-RhoA,MLCP(myosin light chain phosphatase),p-MLCP,MLC(myosin light chain),pMLC蛋白的表达情况。同时对胎鼠的尿道海绵体组织进行体外培养,使用RhoA/Rho激酶通路的抑制剂处理培养中的尿道海绵体组织,观察RhoA、ROCK1、ROCK2mRNA的表达水平。结果成功构建了大鼠尿道下裂模型。免疫组化结果显示与对照组相比,先天性尿道下裂大鼠阴茎组织中p-RhoA表达明显增加。qPCR结果显示,先天性尿道下裂大鼠尿道海绵体组织中RhoA、ROCK1、ROCK2mRNA表达水平明显高于对照组(均P<0.05)。Western blot结果显示,先天性尿道下裂大鼠尿道海绵体组织中p-RhoA、p-MLCP、p-MLC蛋白的表达水平较对照组均明显升高(均P<0.05)。体外培养尿道海绵体组织实验发现,RhoA/Rho激酶通路抑制剂可阻碍RhoA/Rho激酶信号通路激活,从而抑制RhoA、ROCK1、ROCK2的表达并减轻DEHP对雄性胎鼠尿道段组织正常发育的抑制作用。结论 RhoA/Rho激酶信号通路激活与先天性尿道下裂的发生有关,抑制RhoA/Rho激酶信号通路激活可降低RhoA、ROCK1和ROCK2表达从而促进尿道海绵体组织正常发育。

染色改进梅毒质控物的制备及其应用

目的目前大多数检测机构所使用的梅毒质控物其颜色与检测的血清标本一样,都为无色透明或微黄色,出现加错、漏加或者量不足的情况很难用肉眼分辨,为了避免这种现象,该实验采用染料将质控物颜色进行改进。方法采用自制经染色剂改进的梅毒质控物的制备方法制备0.125、0.250、0.500NCU/mL 3个浓度的染色质控物,使用上海科华和厦门英科新创梅毒诊断试剂盒对其进行检测,并比较结果。结果染色质控物与未染色质控同时采用两种试剂检测,但结果差异无统计学意义(P>0.05),使用两种不同的试剂连续检测不同浓度的质控物20次,检测的变异系数(CV)范围分别为11.7%~13.4%、9.3%~12.9%;使用两种不同的试剂检测不同浓度的染色质控物30d,检测的CV范围分别为10.1%~13.4%、8.08%~12.8%。结论通过柠檬黄染色并未影响梅毒质控物的性能,且该质控物在较长的时间内仍可以稳定的使用,在实际应用中也起到了较为满意的效果,适合临床实验室应用和推广。

染色改进艾滋病质控物的制备及其应用

目的为了改进艾滋病质控物颜色与检测的血清标本难用肉眼分辨而导致的加错、漏加或者量不足的问题。方法研制了0.5、4.0NCU/mL两种浓度的经染色剂改进的艾滋病质控物,使用Bio-Rad和北京万泰艾滋病诊断试剂盒对其进行检测,并比较结果。结果染色质控物与未染色质控同时采用两种试剂检测t值分别为1.306、1.136,差异无统计学意义(P>0.05),使用两种不同的试剂连续检测不同浓度的质控物20次,检测的CV分别为11.8%、10.7%;使用两种不同的试剂检测不同浓度的染色质控物20d,检测的CV分别为11.5%、9.8%。结论通过柠檬黄染色并未影响艾滋病质控物的性能,并且在较长的时间内可以稳定地使用,适合临床实验室应用和推广。

Nycodenz-密度渗透压介质离心分离人外周血单核细胞研究

目的研究人外周血单核细胞分离方法。方法采集24名健康志愿献血者外周血,分别以EDTA-K2、肝素钠、枸橼酸钠抗凝,将抗凝全血或单个核细胞悬液缓慢加入不同密度和渗透压组合的Nycodenz-NaCl溶液上层,离心分离单核细胞;EDTA抗凝血经Ficoll-Hypaque密度梯度离心获得的单个核细胞,再分别用Nycodenz-NaCl密度渗透压介质离心法、Percoll密度梯度离心法、贴壁法、MACS(抗CD-14磁珠)分离单核细胞。结果如上4种方法获得的单核细胞纯度和收获率中位数(M)分别为98.9%和68.5%、89.6%和64.5%、64.8%和60.5%、94.1%和73.5%,比较显示Nycodenz法获得的单核细胞纯度最高(P<0.01);吞噬指数和趋化指数分别为188.8±11.2和26.8±5.9、187.8±12.2和26.1±5.1、144.4±24.8和15.4±7.3、177.1±18.3和18.9±6.7,统计表明Percoll法和Nycodenz法获得的单核细胞的吞噬指数、趋化指数高于贴壁法和MACS法(P<0.05);单核细胞受LPS刺激分泌细胞因子IL-12p70、IL-10、TNF-α水平(pg/ml)分别为2 545±341、1 216±397、3.999±418,2 489±425、1080±277、3 891±446,2 147±223、794±180、3268±411,35±12、142±81、407±199,比较得知MACS的单核细胞受LPS刺激分泌细胞因子IL-12p70、IL-10、TNF-α水平非常显著低于其他方法(P<0.01);单核细胞经典亚群CD14+CD16-HLA-DR+百分比和非经典亚群CD14+CD16+HLA-DR+百分比(M)分别为89%和5%、88%和1%、73%和1%、51%和36%,统计表明MACS法的单核细胞经典亚群百分比明显低于其他分离方法(P<0.01),而非经典亚群百分比明显高于其他方法(P<0.01)。结论 Nycodenz-NaCl密度渗透压介质离心法能够分离获得较高纯度、较多经典型的单核细胞。

CTGF在肝纤维化过程中的表达变化及其对大鼠肝星状细胞功能的影响

目的探讨结缔组织生长因子(CTGF)在肝纤维化过程中的表达变化,并观察其对大鼠肝星状细胞(HSC)功能的影响。方法采用ABC免疫组化法观察肝纤维化动物模型制模后不同时间点的CTGF表达变化;构建CTGF 2个不同基因位点的shRNA重组体质粒并转染HSC,利用实时PCR检测CTGF表达,通过MTT及细胞粘附实验检测细胞功能变化。结果随着肝纤维化进展,CTGF阳性表达呈增强趋势(P<0.05);成功构建表达靶向CTGF的shRNA重组真核表达质粒;MTT实验结果显示干扰质粒组细胞增殖水平[吸光度值为(0.81±0.06)]弱于对照组(1.39±0.07)及阴性质粒组(1.28±0.06),均P<0.05;细胞粘附实验表明干扰质粒组细胞粘附率为(38.1±6.2)%,明显低于对照组的(63.1±3.6)%和阴性质粒组的(62.2±5.0)%,均P<0.05。结论 CTGF参与了肝纤维化的过程,是促进肝纤维化发展的最重要细胞因子之一,且表达水平随肝纤维化进展逐渐升高。CTGF shRNA重组体能明显抑制HSC的增殖和粘附能力。

异基因造血干细胞移植后纯红细胞再生障碍性贫血发生的影响因素分析

目的分析异基因造血干细胞移植后纯红细胞再生障碍性贫血(PRCA)发生的危险因素。方法收集完成全部观察的225名与供者HLA匹配的异基因造血干细胞移植患者,其中21例(9.33%)发生移植后PRCA。用SPSS统计分析软件对移植红细胞生长延缓期时间(d)、免疫溶血病发生、ABO血型相容性、aGVHD分级、原发病、血浆sHLA-G1和G5含量以及年龄、性别等作单因素Logistic回归分析,然后对有明显差异的观察指标作多因素Logistic回归分析。结果单因素Logistic回归分析显示:ABO血型相容性、aGVHD分级、原发病、sHLA-G5含量、患者年龄及性别等因素OR值分别为0.596、0.553、1.079、1.007、1.023和2.961(P值分别为0.129、0.720、0.173、0.227、0.334和0.110),移植后红细胞生长延缓期时间、sHLA-G1含量以及溶血病发生对累积Logistic模型的OR值分别0.983、0.033、12.799(P值分别为0.001、0.033、0.003),多因素Logistic回归分析结果显示移植后红细胞生长延缓期时间、sHLA-G1含量以及溶血病发生对Logistic模型有统计学意义(OR值为1.017、0.964、0.110,P值分别为0.001、0.045、0.006)。结论移植红细胞生长延缓期时间、血浆sHLA-G1含量以及溶血病发生是移植后PRCA发生的主要影响因素。

一种定量PCR试剂盒通过血液诊断HCMV感染效能的Meta分析

目的通过Meta分析,评价达安荧光定量PCR试剂盒通过血液诊断HCMV感染的效能,为HCMV血筛方法的研发提供依据。方法计算机检索中文科技期刊全文数据库、中国期刊全文数据库、万方数字化期刊、Pub Med等数据库,检索通过达安荧光定量PCR试剂盒血液诊断HCMV感染的文献,按照纳入和排除标准筛选文献,提取纳入文献的数据,采用Meta-Disc软件进行Meta分析,检验异质性,根据异质性结果选择相应的效应模型,对纳入文献予以加权定量合并,计算汇总敏感度、特异度、阳性似然比、阴性似然比和诊断优势比及其95%CI,绘制汇总受试者工作特征(SROC)曲线,并计算曲线下面积(AUC)。结果共检出相关文献829篇,按照文献纳入标准,最终纳入5篇文献,汇总敏感度为0.94,95%CI(0.89-0.97)、汇总特异度为0.92,95%CI(0.89-0.85)、汇总阳性似然比为11.37,95%CI(7.4-17.46)、汇总阴性似然比为0.07,95%CI(0.04-0.13)、汇总诊断比数比为169.90,95%CI(74.00-390.06),SROC AUC为0.98。结论达安荧光PCR定量试剂盒通过血液诊断HCMV感染具有较高的灵敏度、特异度及稳定性。

铸造金属高嵌体修复后牙大面积缺损

铸造金属高嵌体修复后牙大面积缺损魏斌１余谨２后牙大面积缺损，单独用充填的方法修复，容易造成充填物折脱、牙冠劈裂或咬恢复不良等，往往需要加金属全冠保护，但全冠又易造成龈炎．３年来，作者使用铸造金属高嵌体修复大面积缺损后牙３２例，效果显著，现报道如下：...

中国献血人群人巨细胞病毒-IgG阳性率的Meta分析

目的为建立适合我国输血性巨细胞病毒感染(TT-CMV)的防控策略提供参考。方法计算机检索Pub Med、EMbase、CNKI、VIP、Wan Fang Data和CBM数据库中有关我国献血人群人巨细胞病毒(HCMV)-IgG阳性率的相关文献,检索时限为建库时至2016年11月。由4位研究人员按照纳入与排除标准独立筛选包含研究对象为中国大陆地区献血人群,利用HCMV-IgG酶免方法检测、统计HCMV-IgG阳性率且能提供检测例数和阳性例数的文献,并排除小样本文献和剔重。在对纳入的文献资料做提取和方法学质量评价后,使用R3.1.1软件做Meta分析。结果从334篇初筛文献中最终筛选出合格文献20篇,共计25 918例检测数据纳入Meta分析;获得纳入文献的资料包括题目、作者、发表时间、研究地区、HCMV-IgG检测例数、HCMV-IgG阳性例数、HCMV-IgG检测试剂来源;方法学质量评价显示:纳入文献的平均质量得分3.85,接近高质量研究标准(≥4,满分为5);Meta分析:我国献血人群HCMVIgG阳性率的合并值为87.1%[95%CI(79.4%,93.2%)]。分层分析:男、女阳性率分别为86.6%vs 87.9%(P<0.01);≤24岁年龄组与>24岁年龄组阳性率分别为82.9%vs 92.9%(P<0.01);≤25岁年龄组与>25岁年龄组阳性率分别为84.4%vs 89.3%(P<0.01)。发表偏倚检测:纳入文献无发表偏倚,Meta分析结果可信度较高。结论本组除内蒙、青海2地,我国大部分地区献血人群HCMV-IgG阳性率较高,较难获得HCMV血清学阴性血液;本次纳入文献的Meta分析证实性别和年龄确为影响我国献血人群HCMV-IgG阳性率的因素。

武汉血液中心HBV酶免阳性血清的核酸检测抽样分析

目的监测本中心乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV))酶免检测模式下阳性结果的准确度,为引入核酸扩增检测(nucleic acid amplification testing,NAT)后,探索新的HBV酶免检测模式提供参考。方法随机抽取2011年7月～2011年12月HBV酶免检测阳性标本108例进行核酸检测,将核酸检测结果与血清学结果进行对比,分析两种方法的符合率及差异原因,并进行分类统计。结果抽查的54例酶免双阳性标本的核酸检测结果中,53例为阳性,1例为阴性,符合率为98%。抽查的54例单一酶免阳性标本的核酸检测结果中,4例为阳性,50例为阴性,符合率为7.4%。

温度诱导液态In-80％Sn合金结构非连续变化的分形分析

用分形理论探讨了液态In-80％Sn结构及其变化,证实了液体结构中存在分形结构,发现随着温度的升高,与液态合金其它结构参数一样,分形维数也发生了不连续的变化,提出分形维数是一个结构敏感参量．分析认为液态In—Sn合金结构所出现的不连续变化是由于液体中粒子集合体线度减小而出现的线度效应所造成的,分形维数的突变是温度诱导液态结构不连续的基本特性．

中国普通人群中HHV-8阳性率Meta分析

目的运用Meta分析中国普通人群中HHV-8(人类疱疹病毒8型)的感染情况,为临床HHV-8检测必要性提供基础数据。方法检索中国知网等数据库,对符合纳入标准的文献运用R3.1.1软件进行Meta分析,计算阳性合并率并发表偏倚评估。结果获得符合纳入标准的文章13篇,共调查12828例,中国普通人群中HHV-8阳性率合并值为9%[95%CI(7%,13%)]。分层分析:男女阳性率分别为9%,9%(P<0.01);≤30,31-40,≥41年龄组阳性率分别为7%,9%,11%(P<0.01)。发表偏倚检测:纳入文献异质性检测(I2=97.3>50%,P<0.1),异质性较高出现偏倚。结论中国普通人群中HHV-8感染率较高,呈现显著的地域分布差异,在输血及器官移植术前检测有潜在风险,需加强对HHV-8检测的重视和干预工作。

全血标本离心前不同保存温度与时间对巨细胞病毒核酸检测结果的影响

目的探讨全血标本离心前不同温度与时间对人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)核酸检测(nucleic acid amplification test,NAT)结果的影响,以确定离心前放置的安全时限。方法采集含高、中、低DNA载量的全血。采血后按保存温度分为4℃、25℃、37℃组,各组放置0、1、6、12、24、48、72 h后进行离心,行实时荧光定量PCR。结果高浓度4℃组离心前放置72 h,25℃与37℃组离心前放置24 h,无明显变化;中浓度4℃组离心前放置24 h,25℃组、37℃组离心前放置12 h,无明显变化;低浓度4℃组、25℃组离心前放置12 h,37℃组离心前放置6 h,无明显变化。结论为保证HCMV NAT结果的准确性,全血标本最好在离心前4℃保存,并在采血后6 h内及时离心送检,高温条件下更应注意。

HBV酶联免疫阳性血清的核酸检测抽样分析

乙肝是由HBV引起的病毒性肝炎。我国是乙肝的高发国家，为确保临床用血安全，自1993年卫生部颁布《血站基本标准》后，血站对所有采集的血液标本使用酶联免疫（ELISA）试剂进行HBV检测。随着试剂质量不断提高，输血感染乙肝的风险已大大降低。但由于ELISA法检测的是HBV的抗原或抗体，而“窗口期”、病毒变异、低滴度抗原及非典型血清转阳过程等因素易造成HBV的漏检。核酸扩增检测技术（NAT）可以和ELISA形成互补，有效提高病毒感染血液窗口期的检出率，进一步降低经输血传播病毒的风险，武汉血液中心自2011年7月引入Roche公司的COBASS201核酸检测系统，逐步开展了血液筛选的NAT研究。

武汉市450例无偿献血者中HHV-8病毒的检测及基于ORFK1基因的分型研究

目的:了解武汉市无偿献血人群中人类疱疹病毒8型(human herpes virus 8,HHV-8)的感染情况。方法:对武汉市450例无偿献血者的全血样本分别进行全基因组DNA的提取和血清的采集;采用PCR和ELISA 2种方法进行HHV-8阳性检测,比较2种方法阳性检出率之间的差异性;将检测结果为阳性的PCR样本再进行HHV-8 ORFK1基因的克隆,通过测序分析,同源性比对,进化树构建等对阳性样本进行HHV-8 ORFK1基因分型。结果:PCR和ELISA 2种方法分别检测出25例和23例阳性样本,其阳性率分别为5.56%和5.11%;χ2检验分析表明2种检测方法检出结果无统计学差异(P>0.05)。对23例阳性样本的ORFK1基因的克隆、序列分析结果显示,在23例阳性样本中有15例属于HHV-8 ORFK1基因C亚型,8例属于HHV-8 ORFK1基因A亚型。结论:武汉市无偿献血人群中存在一定比例的HHV-8感染,建议增加对无偿献血者的HHV-8病毒筛选,以保证血源质量。

改良TMB比色法替代^(51)Cr释放法检测抗体依赖细胞细胞毒效应研究

目的建立一种无致癌性、无放射性、灵敏的33,’,55,’-四甲基联苯胺(TMB)检测ADCC实验中靶红细胞自然释放的微量Hb含量的改进方法。方法利用Hb类似过氧化物酶效应催化双氧水氧化33,’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB),使其发生显色反应,改进吸光度在600 nm处的检测体系。采用Nycodenz密度渗透压介质分离单核细胞作为ADCC的效应细胞。比较2种情况的灵敏度,并与51Cr释放法进行方法学对照。在ADCC实验中,分别用51Cr释放法和改良TMB法测定Hb自然释放率。结果显色反应结束后加硫酸酸终止测定最大吸收波长移至450 nm,不加酸终止测定波长为600 nm。不加硫酸终止的TMB法检测Hb低检出限是0.0075 g/L,显色时间20min,TMB最优浓度是0.62 g/L,空白吸收始终稳定的维持在<0.003的较低值。而加酸终止的TMB法低检出限仅为0.5 g/L。显然不加酸终止的改良TMB法的灵敏度非常显著地高于加酸终止的TMB法。在测定ADCC靶红细胞自然释放率试验中,不加酸终止的改良TMB法仅需4 h孵育时间以及2.5×106 cell/ml红细胞浓度即可测定出释放Hb含量,而加酸后孵育时间要长达14 h并且需要更高浓度的红细胞才能测出自然释放Hb含量。用不加硫酸终止的TMB法检测ADCC活性与51Cr释放法相关性良好(r=0.999)。结论改良TMB比色法可以代替51Cr释放法检测ADCC的靶红细胞细胞毒效应。加酸终止、测定波长为450 nm的TMB比色法的灵敏度与51Cr释放法的灵敏度有显著差距,不适用低活性ADCC效应检测。

人表皮角质形成细胞中PAI-3/PCI的表达及作用

目的探讨人表皮角质形成细胞(KERATINOCYTE,KC)中,PAI-3/PCI的表达及作用。方法利用免疫细胞化学、RT-PCR方法,检测高CA2+浓度作用下,培养的人分化表皮KC及KC提取物角质壳中PAI-3的表达变化。结果高CA2+浓度下培养24H后,分化标记物K10弱阳性表达,PAI-3呈阳性表达;培养48H后,K10强阳性表达,而PAI-3的阳性表达明显增加,72H后,表达开始降低,在低CA2+浓度下阳性染色主要位于细胞核膜周围而高CA2+浓度下主要位于细胞质,同时,PAI-3存在终末分化KCS角质壳中。结论人表皮KC分化过程中,PAI-3的表达随着分化的增加而增加,PAI-3存在终末分化KCS角质壳蛋白中,表明PAI-3参与KC分化的作用。

Ca^(2+)调节人表皮角质形成细胞中PAI-3的表达

目的探讨Ca2+对人表皮角质形成细胞(keratinocyte,KC)中PAI-3表达的调节作用。方法利用免疫细胞化学、RT-PCR方法,检测高低Ca2+浓度作用下,培养的人表皮KC中PAI-3的表达变化。结果PAI-3 mRNA及蛋白质在高低Ca2+浓度下培养的人表皮KC中均有表达,并且高Ca2+浓度培养条件下较低Ca2+浓度下明显增强。PAI-3阳性染色在低Ca2+浓度培养下主要位于核膜周围,而在高Ca2+浓度培养条件下主要位于细胞质。结论Ca2+调节人表皮KC中PAI-3的表达,PAI-3可能具有调节KC分化的作用。