ZFNs、TALENs和CRISPR-Cas基因组靶向编辑技术及其在植物中的应用

锌指核酸酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)、转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effectors nucleases,TALENs)和RNA介导的CRISPR-Cas系统是当今三种主要的基因组靶向编辑技术,ZFNs和TALENs由特异性的DNA结合蛋白融合一个非特异性的核酸酶FokⅠ组成,DNA结合蛋白特异识别并结合靶DNA序列,然后在FokⅠ的作用下引起靶位点的DNA双链断裂(double strand breaks,DSBs);而CRISPR-Cas系统,则是由小分子向导RNA通过碱基互补配对与靶基因组序列结合,而引导Cas核酸酶切割靶位点而引起DSBs。DSBs通过真核细胞DNA修复机制(非同源末端连接和同源重组)进行修复,从而实现基因组靶向编辑。本综述着重介绍这三种技术的基本结构及其基因组靶向编辑的原理和特点,对三种技术在植物中的应用进展进行介绍并对其进一步的发展提出了展望。

CRISPR-Cas9多靶点载体构建及高效定向编辑水稻苯达松抗性基因CYP81A

水稻CYP81A6基因(Bel)编码的细胞色素P450单加氧酶对苯达松和磺酰脲类除草剂具有抗性,该基因的隐性纯合突变体(bel)表现为苯达松敏感致死性,可作为植物化学致死标记,在水稻杂交制种中具有重要的应用价值。本研究在CYP81A6基因的首个外显子中设计两个靶位点,构建了含多靶点的CRISPR-Cas9载体,通过根癌农杆菌介导法转化粳稻中花11,获得了56株转基因T0代阳性植株,提取其中9株基因组DNA进行靶位点测序检测,发现基因敲除突变率为77.8%,其中纯合突变率高达71.4%,对纯合突变体水稻喷施苯达松,均表现出对苯达松敏感致死。为应用CRISPR-Cas9技术培育苯达松敏感致死水稻不育系和对其他水稻基因进行编辑提供理论依据。