日本鳗鲡混合感染迟缓爱德华氏菌与创伤弧菌的分离与鉴定

目的对日本鳗鲡混合感染迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的病原进行了分类鉴定。方法对两株病原菌进行了形态、API-ID32E鉴定系统和分子生物学鉴定,分别测定了菌株AnGH080301和An-GH080302的16SrRNA和HSP60基因序列,构建了系统进化树。结果按形态特征和API-ID32E鉴定系统分别初步鉴定菌株AnGH080301和AnGH080302为迟缓爱德华氏菌和创伤弧菌。菌株AnGH080301的16SrRNA基因部分序列(登录号FJ646618)与迟缓爱德华氏菌的16S rRNA基因(登录号AB050832)同源性最高,达99.7%;菌株AnGH080302的HSP60基因部分序列(登录号FJ646619)与创伤弧菌HSP60基因(登录号BA000037)的同源性最高,达99.8%。结论综合菌株的生理生化特性和分子生物学鉴定结果,可将菌株AnGH080301和AnGH080302分别鉴定为迟缓爱德华氏菌和创伤弧菌,迟缓爱德华氏菌与创伤弧菌均为人兽共患病病原,其混合感染日本鳗鲡致病的报道尚属首次。

诸氏鲻虾虎鱼卵黄蛋白原基因全长cDNA的克隆及表达

为了探讨诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobius chulae)卵黄蛋白原组织分布及17β-雌二醇(E2)暴露对雄性诸氏鲻虾虎鱼Vg的影响,作者采用RT-PCR、RACE方法克隆并分析了诸氏鲻虾虎鱼卵黄蛋白原(Vg)基因的全长cDNA序列,并对Vg在诸氏鲻虾虎鱼体内的组织表达分布及E2诱导后不同时间表达规律进行了研究。结果表明:获得的Vg cDNA序列全长5 067 bp,开放阅读框(ORF)含4 992 bp,编码1 663个氨基酸,含有信号肽、多丝氨酸区域,推测其编码氨基酸分子量为186.2 ku,等电点为9.31。荧光定量PCR结果显示,Vg在诸氏鲻虾虎鱼肝脏中表达量最高。E2诱导后,诸氏鲻虾虎鱼肝脏中Vg m RNA的表达量第1天达到小高峰,第3天达到高峰,第7天开始明显下降,第11天仍能维持较高水平。本研究成功克隆了诸氏鲻虾虎鱼Vg基因全长cDNA序列,诸氏鲻虾虎鱼肝脏是Vg主要合成场所,E2诱导雄性诸氏鲻虾虎鱼Vg的表达作为生物标志物用于近海环境雌激素类物质的检测具有良好的应用前景。

诸氏鲻虾虎鱼“溃烂病”病原及其致病影响因子分析

为研究诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobius chulae)"溃烂病"病原及其致病性,对患病鱼进行了病原分离、人工感染实验以及病原生理生化鉴定和gry B分析,研究了不同温度、盐度、p H条件对其致病性的影响。结果显示,病原菌为迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda),对诸氏鲻虾虎鱼和斑马鱼(Danio rerio)的半致死剂量(LD50)分别为57 CFU·尾^(–1)和2.0×10~4 CFU·尾^(–1),毒力基因(cit C、muk F、esr B、kat B、fim A、gad B)检测结果均为阳性,其基因序列与已知迟缓爱德华菌相应的毒力基因序列同源性高达99%。病理结果显示,患病鱼肾脏、肝脏、皮肤细胞均出现不同程度的变性、坏死和炎性细胞浸润等,其中肾和肝组织病变最为严重。25℃和30℃实验组5 d累计死亡率分别为(33±15)%、(60±10)%,显著高于20℃实验组和对照组(P<0.05);盐度15和30实验组5 d累计死亡率分别为(60±10)%、(63±21)%,显著高于盐度3实验组[(20±10)%,P<0.05];而p H 6.0、p H 7.5、p H9.0实验组之间5 d累计死亡率无显著差异(P>0.05)。结果表明,迟缓爱德华菌是诸氏鲻虾虎鱼"溃烂病"病原,具有强致病性,养殖温度和盐度对其致病性具有显著影响。

诸氏鲻虾虎鱼致病性创伤弧菌的分离与鉴定

从患病的诸氏鲻虾虎鱼分离病原,研究其致病性。通过形态学观察、生理生化特性、HSP60序列扩增及系统发育树分析等方法系统鉴定,并进行了人工感染和毒力基因检测。结果表明,从患病的诸氏鲻虾虎鱼肝脏组织分离到1株革兰阴性杆菌,编号PYMc14-2,回归感染试验证实该菌株为诸氏鲻虾虎鱼的病原菌,毒力基因hemo检测结果阳性。生化特性结果与创伤弧菌类似,PCR扩增获得的486bp的HSP60基因序列与创伤弧菌(登录号AF230955.1)同源性达94%;系统进化树分析表明,PYMc14-2与创伤弧菌(登录号AF230955.1)聚为一簇,初步鉴定该菌为创伤弧菌。

实验鱼质量控制标准研制的思考与建议

实验鱼作为重要的实验材料,在生命科学、医学以及水环境安全性评价等研究中发挥着越来越重要的作用。目前,国内实验鱼生产量和研究队伍发展迅速,实验鱼的使用量也逐年上升,但实验鱼质量良莠不齐,可能对科学实验结果造成严重影响,因此迫切需要制定实验鱼质量控制标准对其生产加以规范和引导。本文就实验鱼质量控制及其研究现状进行综述,以期为实验鱼质量控制标准的制定提供建议和参考。

费氏弧菌急性毒性微孔板检测方法优化

为优化费氏弧菌(Vibrio fischeri)急性毒性微孔板法测试条件,以发光强度或发光抑制率为指标,研究温度、盐度、p H、反应体系、稀释比例、传代次数对费氏弧菌新鲜菌液生物毒性测试的影响。结果表明:费氏弧菌适宜培养温度为15~20℃;检测适宜温度为15℃,盐度为15‰~35‰,p H为5~10,检测体系为1∶10,传代次数不宜超过10代,不同稀释比例对新鲜培养的生长平台期费氏弧菌毒性测试无显著影响。基于优化后的方法,七水硫酸锌、氯化汞、十二烷基硫酸钠、苯酚对费氏弧菌急性毒性具有显著的剂量-效应关系,表明该优化方法适用于上述物质的毒性评价。

GFP标记的迟缓爱德华菌感染诸氏鲻虾虎鱼后组织分布研究

为探讨迟缓爱德华菌(Edwarsiellatarda)入侵途径,建立感染模型,作者通过电转化法构建GFP标记的迟缓爱德华菌EtMc1512(质粒PMDpp-EGFP),实验设立浸泡组、腹腔注射组和肌肉注射组,感染后采集各组实验诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobius chulae)血液、鳃、肝脏、肠、肌肉,培养法统计分析各组织中的荧光细菌数;浸泡组取样时间为0、2、4、6、8、12、24 h,腹腔注射组和肌肉注射组取样时间为6、12、24、48、72、96h。结果显示,构建的EtMc1512-GFP具有较强荧光,GFP标记前后菌株毒力基因(citC、mukF、esrB、katB、fimA、gadB)检测结果均为阳性。浸泡感染后实验鱼各组织内的荧光菌随时间表现为先升后降的趋势,最高菌量出现在肠道(2.51×106CFU/g),其次为鳃(4.19×104CFU/g)、血液(1.65×104CFU/g),肠道荧光菌显著高于其他组织(P<0.05);腹腔注射感染后肝脏(4.55×106CFU/g)和血液(4.65×106CFU/g)菌量最高;肌肉注射感染后肌肉在48h首先检出荧光菌,血液(2.93×104 CFU/g)菌量最高。结果表明,肠道、肝脏和肌肉分别是迟缓爱德华菌浸泡感染、腹腔注射感染和肌肉注射感染诸氏鲻虾虎鱼的主要组织器官,在自然条件下迟缓爱德华菌经口感染诸氏鲻虾虎鱼风险较高。

诸氏鲻虾虎鱼出血病病原鉴定及传播途径分析

目的分离鉴定诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobius chulae)出血病病原,并探讨其传播途径,为虾虎鱼微生物质量控制提供技术依据。方法从患出血病虾虎鱼肝脏取样分离病原菌,经菌落形态、生化特性和分子特征鉴定细菌,回归感染确定其致病性,并采用双重PCR方法对虾虎鱼、轮虫、卤虫、水进行嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)检测。结果分离到1株优势菌PYMc15-1,该菌株API生化反应结果与嗜水气单胞菌一致,gry B序列与Gen Bank上的嗜水气单胞菌相应基因序列同源性最高;根据已知序列构建gry B分子系统进化树,分离株PYMc15-1与嗜水气单胞菌聚类;分离株PYMc15-1溶血素基因(hly A)和气溶素基因(aer A)检测结果阳性,对虾虎鱼半致死剂量(median lethal dose,LD50)为每尾1.2×104cfu。野生虾虎鱼、卤虫和野生轮虫致病性嗜水气单胞菌检测出现阳性结果,虾虎鱼封闭群、室内培育的轮虫以及海水样品致病性嗜水气单胞菌检测均为阴性。结论嗜水气单胞菌可自然感染虾虎鱼;野生虾虎鱼和生物饵料是其潜在传播媒介,引进虾虎鱼和生物饵料时应检测该病原。

诸氏鲻虾虎鱼转录组序列中微卫星标记的初步筛选及特征分析

旨在为大规模开发诸氏鲻虾虎鱼微卫星标记,采用高通量测序技术,对诸氏鲻虾虎鱼肝脏转录组进行了测序。结果共获得47 979条Unigenes,利用微卫星查找程序在47 979条Unigenes中共获得6 225个微卫星位点(12.97%),平均每7.02 kb就出现1个微卫星位点。6 225个微卫星位点由226种重复基序组成,主要分布在三、四和五碱基重复类型中。在数量上,单碱基重复类型微卫星位点最多,占42.49%,二碱基和三碱基重复类型所占比例相似,分别为25.22%和26.27%,四、五、六重复类型较少,合计占6.03%。单碱基重复序列中最多的类型为A/T,二碱基重复序列中以AG/CT重复单元为主,三碱基重复序列中以AGC/TCG为优势类型。挑选部分二、三和四单元重复类型微卫星序列,共设计76对引物,可稳定扩增出目的条带的有55对,其中32对具有多态性。结果表明,利用诸氏鲻虾虎鱼转录组数据可快速大量开发微卫星标记。

鳗源迟缓爱德华氏菌菌蜕的构建及制备条件优化

菌蜕具有完整细菌表面抗原结构,可诱导机体的体液和细胞免疫应答,成为疫苗制备的候选之一,为了探讨鳗鲡迟缓爱德华氏菌菌蜕疫苗的可行性,实验采用基因重组技术构建了噬菌体PhiX174裂解酶基因(Lysis E)的温控表达载体,转化迟缓爱德华氏菌,成功制备其菌蜕,并对菌蜕形态、溶菌动力学、裂解效率以及制备条件等进行了研究。结果表明,细菌菌蜕表面形成溶菌孔道,细胞因内容物流失而发生明显的皱缩;构建的迟缓爱德华氏菌诱导后1 h开始裂解,5 h后裂解基本完成,裂解效率为99.99%,冷冻干燥后重悬涂布平板,未检出活菌,电镜观察表明冻干前后细胞形态未见明显变化;构建的迟缓爱德华氏菌分别在OD600值为0.4和0.6进行诱导,其裂解过程和裂解效率没有明显区别;分别用LB、BHI、NB 3种培养基进行比较研究,其中LB培养基制备的菌蜕细胞较完整、裂解完全,是制备迟缓爱德华氏菌菌蜕最优培养基。本研究成功构建了鳗源迟缓爱德华氏菌菌蜕,并对其制备条件进行了优化,为鳗鲡爱德华氏菌病疫苗开发奠定了基础。

3种免疫途径下迟缓爱德华菌菌蜕疫苗对欧洲鳗的免疫保护效果

为了探讨迟缓爱德华菌菌蜕疫苗预防鳗鲡爱德华菌病的可行性,实验采用腹腔注射、口服、浸泡3种途径探讨了迟缓爱德华菌菌蜕疫苗对欧洲鳗的免疫保护效果。结果表明,免疫后欧洲鳗血清抗体效价均明显升高,但菌蜕疫苗(ETG)组与福尔马林灭活疫苗(FKC)组间血清抗体效价无显著性差异。欧洲鳗注射、口服、浸泡ETG组的相对免疫保护率分别为75.0%、52.5%、37.5%,分别高于FKC组的55.0%、40.0%、32.5%,且ETG组欧洲鳗死亡时间明显推后,表明菌蜕疫苗的免疫保护效果优于福尔马林灭活疫苗。易操作、对鱼体应激少的ETG疫苗口服免疫欧洲鳗获得了52.5%的免疫保护率,在预防鳗鲡爱德华菌病中具有良好的应用前景。

诸氏鲻虾虎鱼实验动物化研究进展

诸氏鲻虾虎鱼是我国特色海洋鱼类,具有诸多实验动物培育与应用优势。本文概述了诸氏鲻虾虎鱼的生物学特性、封闭群和近交系培育、质量控制等实验动物化研究进展,并介绍了诸氏鲻虾虎鱼作为海洋实验鱼类在海洋环境监测、水生态毒理等研究中的应用。结合目前研究和应用现状,对诸氏鲻虾虎鱼的质量标准化、近交系培育及其在功能基因组等领域的应用进行了展望。

鱼类实验动物封闭群和近交系资源培育现状

鱼类实验动物的应用研究已经深入生命科学的各个领域,取得了许多重大研究成果,因国内外实验鱼在来源、代系、培育和管理方式等背景上均较为复杂,为实验鱼质量控制带来诸多不便。针对鱼类实验动物资源培育现状,本文综述了国内外实验鱼封闭群和近交系的培育、管理和标准化等方面的现状和存在的问题,以期为我国实验鱼培育管理和质量控制标准化提供参考。

针灸治疗排卵障碍性不孕症的临床研究概况

目的:通过近10多年来有关针灸治疗排卵障碍性不孕症的文献进行综述,以探讨针灸治疗排卵障碍性不孕症的研究近况。方法:将近10多年来针灸治疗失眠的文献资料按体针治疗、灸法治疗、电针治疗、针药治疗、穴位注射疗法及其他疗法等6个方面进行分类综述。结果:针灸治疗排卵障碍性不孕症疗效显著。

钻井液特征污染物的毒性评估和海洋测试生物的适用性比较

随着海上钻井数量的逐年增加、钻井液的使用量迅速增加,与之相关的环境危害引起了广泛关注,因此有必要筛选合适的毒性测试生物和开发环境友好的钻井液。本研究中,按照ISO11348-1(2007)、GB/T21805-2008和GB/T18420.2-2009的毒性测试方法,采用标准的海洋测试生物:发光细菌(Vibrio fischeri)、牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)、诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobius chulae)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、卤虫(Artemia)、蒙古裸腹溞(Moina mongolica),研究了钻井废液特征污染物(苯酚、七水硫酸锌、氯化汞)以及参比毒物十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)的急性毒性效应。结果表明,钻井液特征污染物对6种海洋生物的急性毒性效应有所不同:Hg2+对海洋生物表现为极高毒性,Zn2+、SDS表现为中、高毒性,苯酚表现为中、低毒性;6种海洋生物对4种特征污染物的敏感性顺序为:蒙古裸腹溞>诸氏鲻虾虎鱼>卤虫>凡纳滨对虾>发光细菌>牟氏角毛藻;诸氏鲻虾虎鱼与卤虫、凡纳滨对虾种间毒性相关性显著,蒙古裸腹溞与发光细菌、凡纳滨对虾种间毒性相关性显著。上述研究结果为环保型海洋钻井液开发和钻井废液生物毒性评价中受试生物的选择提供了基础数据。

实验鱼生物饵料的质量控制

实验鱼个体小,口径小,而微型配合饲料因为水中稳定性、诱食性、可消化性和污染水质等诸多缺点而应用有限。生物饵料具有大小合适、营养丰富,不污染水质等优势,被公认为是当今及今后较长时间内实验鱼的主要饲料。本文对大草履虫、褶皱臂尾轮虫、卤虫等实验鱼常用生物饵料的生物学特性、营养成分、可能携带的病原和有毒有害物质、质控指标等进行综述,以期为实验鱼饲料的质量控制提供参考。

诸氏鲻虾虎鱼封闭群遗传质量评价方法的建立

目的分析诸氏鲻虾虎鱼封闭群和野生群的遗传差异,建立诸氏鲻虾虎鱼封闭群遗传质量评价方法。方法利用20个微卫星标记对诸氏鲻虾虎鱼野生群和封闭群进行STR分型,计算群体间遗传杂合度和遗传分化状况,并分析样本量对遗传参数的影响。结果诸氏鲻虾虎鱼封闭群和野生群在20个微卫星位点的平均无偏期望杂合度(He)分别为0.6927和0.7162。封闭群与野生群间遗传分化较小,且当样本量达到30尾以上后,平均等位基因数趋于稳定。结论遗传杂合度是否在0.5~0.7之间可较好将诸氏鲻虾虎鱼封闭群与野生群区分,适于作为诸氏鲻虾虎鱼封闭群遗传质量合格与否的判定指标。

草鱼鱼种免疫操作流程简述

现在正是草鱼下塘注射疫苗免疫的季节，为了能有效地预防草鱼“四病”（即出血病、

三种海洋微藻光密度计数法的建立与应用

海水小球藻( Chlorella sp. )、亚心形扁藻( Platymonas subcordiformis )和牟氏角毛藻( Chaetoceros muelleri)是海洋绿藻和硅藻中典型种类,因具有营养价值高、生长速度快、易于大规模培养等优点,已经成为鱼、虾、贝等水产动物重要的开口饵料,建立其快速、准确计数方法,对提高藻类利用水平、促进水产苗种工业高质量发展具有重要价值。

一例由进水处理不当引发的鱼病

2012年6月7日．湖北仙桃杨林尾养殖户刘先生打电话来反映他的池塘中从5月31口开始出现大量死鱼，其中6月6～7日两天死鱼最多，达100多尾／天，其他时间每火40～70尾不等。