2020—2022年陕西省手足口病病原的监测及主要型别的流行特征分析

目的 了解2020—2022年陕西省手足口病主要病原构成情况和流行规律。方法 收集陕西省各省辖市手足口监测病例的核酸检测结果和病例资料,分离肠道病毒核酸检测阳性样本,并对流行优势病原的肠道病毒VP1区进行PCR扩增、序列测定和毒株基因亚型鉴定。结果 2020—2022年陕西省共采集6 352例手足口病例样本,肠道病毒核酸检测阳性4 417例(69.54%)。2020年和2021年,以除外EV-A71和EV-A16的其他肠道病毒为主要流行型别,构成比分别为95.43%和74.35%;2022年,以CV-A16型为主要流行型别,构成比52.88%。对8个省辖市4 145例手足口实验室确诊病例开展其他肠道病毒中CV-A6型和CV-A10型检测,2020年—2022年CV-A6型在其他肠道病毒的占比分别是75.31%、62.56%和61.15%,是陕西省其他肠道病毒中的优势流行型别。2020—2022年陕西省分离测序毒株239株,CV-A16型151株,CV-A6型72株,CV-A10型6株,CV-A4型2株,CV-B3型8株。CV-A16型和CV-A6型是主要流行型别,经系统进化分析,CV-A6型以D3亚型为主要流行亚型,CV-A16型以B1a和B1b共存,2021年和2022年B1a亚型占比逐年升高,并取代B1b成为主要流行亚型。结论 2020—2022年陕西省手足口病较往年处于低流行水平,主要病原以其他肠道病毒、CVA16交替出现。

汉坦病毒核蛋白原核表达纯化及其单抗制备

目的制备稳定、特异的汉坦病毒核蛋白重组抗原和单克隆抗体。方法构建汉坦病毒(HTNV)-76118株核蛋白原核表达载体(pBV)220-S1.3和(pET)28a-S1.3,大肠埃希菌诱导表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-blot分析显示,在48kD附近有目的蛋白表达,且有较好的抗原活性。用纯化的包涵体抗原免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经镍合氨基三乙酸(Ni-NAT)亲和纯化的核蛋白包被酶标板,进行ELISA筛选阳性克隆株,并建立细胞系,选2株高效分泌抗核蛋白单克隆抗体(McAb)的阳性杂交瘤细胞,常规制备腹水,进行单抗鉴定。结果成功构建了重组核蛋白原核表达载体pBV220-S1.3和pET28a-S1.3,获得了高纯度重组核蛋白(rNP)及其高效价单克隆抗体2E6和4D8。结论重组核蛋白抗原及其单克隆抗体在流行性出血热的监测、诊断和科研中有重要价值。

IgM捕捉ELISA检测肾综合征出血热试剂盒研制

目的开发可靠、稳定、方便的肾综合征出血热诊断试剂。方法羊抗人μ链抗体包被聚苯乙烯酶标板,纯化抗汉坦病毒核蛋白单克隆抗体,并用辣根过氧化物酶标记后与纯化的汉坦病毒汉滩型(HTNV)核蛋白抗原一起使用作示踪剂,结合四甲基联苯胺-过氧化氢(TMB/H2O2)酶底物系统,制成检测肾综合征出血热早期特异性IgM抗体捕捉ELISA试剂盒。结果与间接ELISA试剂同步检测46份出血热病人血清和46份正常人血清进行对比,2种试剂检测结果完全相符,特异性、稳定性和重现性好。结论重组抗原IgM捕捉ELISA检测试剂盒敏感、可靠,方便基层医院和门诊使用,可用于肾综合征出血热的早期诊断及监测。

急性呼吸道疫情病原学的快速鉴别

[目的]对2007年4月起在陕西高陵县某小学和幼儿园暴发的群体性不明原因发热、咳嗽的急性呼吸道疫情进行病原学快速鉴别研究。[方法]采集流行区新发患儿13例的咽拭子标本,新鲜抽提核酸,对常见12种呼吸道RNA病毒进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和巢式PCR,阳性分离标本接种敏感细胞培养,病变细胞进行免疫荧光鉴定。[结果]13例标本中RT-PCR和巢式PCR检出流感病毒B型阳性7例,其他病毒的特异性条带未检出;全部标本接种MDCK狗肾细胞3d后仅7例阳性检出,流感病毒B型者均出现细胞病变效应,其余未见明显细胞病变;病变细胞对B型流感单抗的直接免疫荧光试验均为阳性反应。[结论]本次急性呼吸道疫情的病原体为B型流感病毒。

汉坦病毒核蛋白及其单抗标记物在建立ELISA试剂中的应用

[目的]利用重组汉坦病毒核蛋白及其单克隆抗体的酶标记物建立IgM捕获ELISA诊断试剂。[方法]制备、纯化重组核蛋白抗原和抗核蛋白单抗并进行辣根过氧化物酶标记,在抗人μ链包被板中结合四甲基联苯胺-过氧化氢(TMB/H2O2)酶底物系统,从血清中检测肾综合征出血热早期特异性IgM抗体,并与免疫荧光抗体法(IFA)进行比较。[结论]检测42份可疑HFRS病人血清,ELISA法和IFA法均阳性的20份,均阴性的19份;ELISA法阴性、IFA法阳性的1份,ELISA法阳性I、FA法阴性的2份,2种方法的差异无统计学意义(配对χ2=0.08,P>0.05)。[结论]用重组汉坦病毒核蛋白及其单克隆抗体的酶标记物建立IgM捕获ELISA诊断试剂可用于HFRS的早期IgM抗体检测。

2006-2015年陕西省其他感染性腹泻流行病学特征分析

目的分析2006-2015年陕西省10年间其他感染性腹泻报告病例的流行病学特征,为其防控提供科学依据和本底数据。方法通过国家"疾病监测信息报告管理系统",对陕西省2006-2015年上报的其他感染性腹泻病例进行特征描述。结果 2006-2015年陕西省共报告其他感染性腹泻207 437例,10年平均年发病率约为52.43/10万,其中男性126 673例,女性80 764例,男女性别比为1.57∶1;0岁~和1~4岁年龄组报告病例最多,共计占总报告病例数的72.48%;病例构成比前3位的职业分别是散居儿童(74.88%)、农民(10.75%)和学生(5.75%);全省发病率最高的市依次是宝鸡、延安和安康;发病时间分布呈夏、冬季两个高峰,夏季高峰出现在7~8月,冬季高峰出现在11~12月;病原检测率为4.60%。病原检测结果显示轮状病毒是陕西省其他感染性腹泻的主要病原。结论陕西省其他感染性腹泻的高危人群为5岁以下儿童,特别是秋、冬季的轮状病毒感染;全省的实验室病原检测率较低,传染病监测质量也急需提高。

5676例手足口病病例分析

目的了解手足口病的临床和流行病学规律,探索恰当、正确的应对措施,有效、经济地开展预防控制工作。方法对5 676例手足口病病例进行临床分类、流行病学分析、肠道病毒71(EV71)和柯萨奇A16(CAV16)病毒核酸检测。结果手足口病发病以幼儿为主,尤其是散居儿童。病例报告存在"周末低谷"和"周一跳跃"现象。轻型病例中病毒核酸检出率高达85.42%,重症病例中病毒核酸检出率仅28.57%,重症病例中有明显挂靠手足口病现象。咽拭子中病毒核酸检出率最高,为71.43%,肛拭子和粪便检出率66.67%,疱疹液检出率最低,为26.67%。结论手足口病是小儿常见传染病,绝大多数为轻型病例,预防的重点是高发期健康教育。

2011-2017年陕西省外环境中禽流感病毒污染情况分析

目的了解陕西省外环境禽流感病毒污染状况,为陕西省人感染禽流感疫情防控、预测和预警提供依据。方法在陕西省选取城乡活禽市场、家禽规模养殖场(户)、家禽屠宰加工厂等不同类型监测场所,采用PCR法对外环境标本进行禽流感病毒核酸检测,多组间率的比较采用χ2检验。结果 2011年1月至2017年12月,共采集外环境标本6 426份,检出A型禽流感病毒阳性率为7.61%。其中H9亚型阳性占74.23%,H5亚型阳性占15.34%,H7亚型阳性占3.89%,A型未分型及混合型阳性占5.73%。发现活禽市场禽流感病毒污染为主;宰杀或摆放禽肉案板表面擦拭标本和清洗禽类污水的禽流感病毒阳性率最高。结论陕西省禽类相关环境中存在禽流感病毒,以H9亚型为主,城乡活禽市场和家禽屠宰加工厂受病毒污染较重。

陕西省2017-2018年冬季流感的流行特征

目的分析陕西省2017-2018年冬季流感的流行特征,为今后流感防控提供参考。方法收集陕西省2015年10月至2018年4月每周流感监测数据,分析2017-2018年冬季全省流感监测哨点医院门诊流感样病例(ILI)情况、流感病毒核酸阳性率、冬季高发期病原谱及暴发疫情情况,并与往年流感流行季进行比较。结果2017-2018年冬季ILI就诊比例平均水平为4.78%(43709/915450),较往年同期水平偏高。门诊ILI病例中,流感病毒核酸阳性率为35.19%,其中乙型Yamagata系占15.39%、甲型H1N1亚型占14.23%、甲型H3N2亚型占4.92%、乙型Victoria系仅占0.52%。2017-2018年冬季流感暴发疫情以小学暴发为主,占45%。2017-2018年流感各年龄组病例阳性率均高于往年水平,6~14岁年龄组发病较高,但与往年发病情况类似。结论陕西省2017-2018年冬季流感流行主要由乙型Yamagata系和甲型H1N1亚型交替流行导致。针对流行特点,需要提高监测敏感性和流感疫苗接种率。

陕西省2005-2017年水痘的流行病学特征分析

目的分析陕西省2005-2017年水痘疫情的流行病学特征,为控制水痘暴发和流行提供依据。方法数据来自中国疾病预防控制信息系统中陕西省2005-2017年水痘报告病例及突发公共卫生事件信息,采用描述性流行病学方法进行分析。结果陕西省2005-2017年共报告水痘病例101 370例,死亡1例,年平均发病率为20.77/10万;有明显的季节性,每年6月和12月出现两个发病高峰。病例主要集中在14岁及以下人群,占总发病数的78.63%,2015年14岁及以下人群年均发病率为208.37/10万;同期共报告水痘突发公共卫生事件98起,主要集中在小学。水痘-带状疱疹病毒进化枝2是陕西优势基因型。结论儿童为水痘的高发人群,应加强学校的监测处理措施及民众疫苗接种意识,进而降低水痘发病率。

携带汉坦病毒宿主动物分布特征研究

目的研究西安地区携带汉坦病毒(HV)宿主种类及分布特点。方法夹夜法捕获宿主动物后鉴定种类,利用荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测宿主动物肺脏中HV核酸。结果 2011-2013年在监测地域共捕获动物2 577只,鼠密度为3.28%,在9月份达到5.6%;其中黑线姬鼠(Aa)占63.4%,小家鼠(Mm)和褐家鼠(Rn)分别占18.98%和12.88%;312份动物标本中检出HV核酸,其中Aa占88.78%,Rn占5.12%,Mm占4.49%,在黄胸鼠(Rf)和北小社鼩(Cs)也检出HV核酸,在8月和9月捕获的阳性宿主占到了全部阳性的56.73%,野外的阳性宿主占到了总阳性的87.82%。结论西安地区鼠密度在9月达到高峰,鼠种主要为Aa,Mm和Rn,携带HV的动物有Aa,Rn,Mm,Rf和Cs等,形成了在野外以Aa为主,居民区以Rn和Mm为主,阳性宿主动物主要出现在野外8月9月,这对本地区防控肾综合征出血热(HFRS)中宿主控制方面具有指导意义。

hVEGF165及hBMP-7双基因共表达腺相关病毒载体的构建及鉴定

目的通过引入内部核糖体进入位点序列(internal ribosome entry site,IRES),构建带有hVEGF165及hBMP-7双基因的重组腺相关病毒载体(adeno-associated virus,AAV),并对其进行鉴定。方法以AAV腺相关病毒包装系统(helper-free system)为基础,将真核表达质粒pIRES中的IRES片段定向克隆至腺相关病毒骨架质粒pAAV-MCS中,形成含有IRES序列及上、下游多克隆位点的重组骨架质粒pAAV-MCS A-IRES-MCS B。PCR扩增hVEGF165和hBMP-7基因,先后亚克隆入重组腺相关病毒骨架质粒IRES序列上、下游的多克隆位点,获得重组质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7。将其和包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pHelper三质粒共转染AAV-293细胞,包装重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7,同时包装含有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的重组病毒rAAV-IRES-GFP作平行对照。荧光显微镜下监测病毒包装效率,收获重组病毒后感染AAV-HT1080细胞测定病毒滴度,并通过病毒基因组外源基因扩增鉴定重组病毒的包装是否成功。结果重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7经双酶切鉴定正确。荧光显微镜下观察三质粒共转染AAV-293细胞72h后,病毒包装效率达95%～100%,收获的重组病毒具有较高浓度及活性,感染AAV-HT1080效率达90%,荧光计数法测定病毒感染滴度达5.5×1011vp/mL。提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的基因hVEGF165及hBMP-7片段,重组病毒包装成功。结论成功构建带有hVEGF165及hBMP-7双基因的重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7,收获的病毒具有较高滴度,为今后利用腺相关病毒载体进行hVEGF165及hBMP-7双基因共表达影响骨修复的体外及体内研究提供实验基础。

2型糖尿病患者肠道乳酸菌属和消化链球菌属定量研究及其意义

目的对2型糖尿病患者与健康人肠道乳酸菌属和消化链球菌属进行定量分析,探讨两组人群肠道菌群的差异。方法提取肠道菌群总DNA,利用菌属特异性引物实时荧光定量PCR扩增,制作菌属标准品和标准曲线,定量分析两种优势菌属在糖尿病患者和健康人群中的含量。结果与健康对照组相比,2型糖尿病组肠道消化链球菌的数量均显著减少,而乳酸菌属的数量两组间无统计学差异。结论荧光定量PCR方法可作为研究肠道菌群的一种准确、敏感的检测方法;糖尿病患者肠道优势菌属发生变化,提示肠道优势菌群可能与糖尿病的发生发展有一定的相关性。

危重症手足口病患儿108例免疫功能分析

目的:探讨手足口病危重症患儿的免疫功能变化及免疫学发病机制。方法:将220例经临床和实验室确诊为EV_(71)感染的手足口病患儿根据病情分为普通型组(112例)和危重症组(108例),以同期门诊健康体检儿50例作为正常对照组,采用流式细胞术检测各组患儿血液中T淋巴细胞(CD_3^+)、B淋巴细胞(CD_(19)^+)和NK(CD_(16)^+CD_(56)^+)细胞百分比的变化。结果:手足口病患儿尤其危重症组血液中T淋巴细胞(CD_3^+)和NK(CD_(16)^+CD_(56)^+)细胞百分比较正常对照组显著下降(P<0.05),B淋巴细胞(CD_(19)^+)百分比较正常对照组显著升高(P<0.05);普通型和危重症患儿恢复期T淋巴细胞(CD_3^+)较急性期显著增加(P<0.05),B淋巴细胞(CD_(19)^+)和急性期相比无显著差异(P>0.05),而NK(CD_(16)^+CD_(56)^+)细胞却显著降低(P<0.05)。结论:手足口病患儿存在细胞免疫和体液免疫功能紊乱,对手足口病患儿免疫功能了解有助于判断病情、指导治疗。

陕西省手足口病重症和死亡病例的流行特征及肠道病毒71型VP1区基因特征分析

目的了解陕西省手足口病(HFMD)重症和死亡病例的流行特征及肠道病毒71型(EV-A71)基因特征,为制定防控措施提供参考依据。方法对2010-2015年陕西省HFMD监测数据和病原学资料进行分析,选择重症和死亡病例的EV-A71分离株用RT-PCR方法扩增VP1基因片段,MEGA5.0软件分析同源性并构建系统进化树。结果 2010-2015年陕西省共报告HFMD重症病例5 054例,死亡病例118例,年均报告死亡率0.052 09/10万,重症病死率2.32%。5-7月为重症和死亡病例发病高峰,西安、渭南、咸阳为高发地区。病例集中于3岁以下儿童,分别占重症和死亡病例总数的90.84%和93.22%,男性高于女性,男女性别比1.67∶1。病原学监测重症病例中EV-A71、CV-A16和其他肠道病毒的构成比分别为66.39%、6.26%和27.35%,不同年份的各病原构成有统计学差异(χ~2=307.827,P<0.001)。不同年龄组的EV-A71检出率最高,且随着年龄的增加不断增高,差异有统计学意义(χ~2=50.688 18,P<0.001)。死亡病例中EV-A71检出率达96.83%。29株EV-A71分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为94.2%～99.7%和98.0%～100%,与我国C4亚型代表株之间具有高度同源性,属于EV-A71病毒的C4基因亚型C4a进化分支。结论应做好重点地区、高发季节和≤3岁儿童的HFMD防控工作,密切关注EV-A71病原流行变化趋势,采取有效措施降低重症和死亡病例的发生。

陕西省高陵县乙型流感暴发疫情的病原学检测报告

目的弄清陕西省高陵县某小学学生群体发热疫情的病因。方法采集住院病例的鼻拭子标本7份和鼻咽拭子标本13份,用流感快速检测试剂检测流感病毒抗原;RT-PCR法检测流感病毒核酸;接种MDCK细胞分离流感病毒。结果鼻拭子标本有4份乙型流感病毒抗原阳性。阳性率为57.14%(4/7)。鼻咽拭子混合标本12份检出乙型流感病毒核酸,阳性率为92.31%(12/13)。鼻咽拭子标本经细胞培养,其中10份标本出现细胞病变。经鉴定为乙型流感病毒,病毒分离率为76.92%(10/13)。结论这起暴发疫情是由乙型流感病毒引起。

2011-2015年陕西省克雅氏病监测病例特征分析

目的了解陕西省克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease,CJD)的发病情况、临床表现及流行病学特征,为科学防控CJD提供依据。方法采集了2011-2015年陕西省7家医院报告的49例可疑CJD病例的临床及流行病学信息,收集了患者的血液及脑脊液样本。对脑脊液样本,通过免疫印迹法检测14-3-3蛋白。对血液样本,提取核酸,通过聚合酶链反应,扩增朊蛋白基因;利用测序技术,测定其突变情况,同时对129位和219位氨基酸进行多态性分析。结果确定散发型CJD临床诊断病例16例,散发型CJD疑似诊断病例4例,遗传型CJD 1例。病例的地理分布和职业无明显聚集性;散发型CJD临床诊断病例发病年龄中位数为62岁,男女比例1.29∶1;快速进行性痴呆为最常见的首发症状,占全部诊断病例的47.62%。结论陕西监测到的CJD病例主要为散发型CJD,收集到的病例的年龄、性别比例、职业情况及住址分布等均符合散发型CJD的分布特点。

NEP1-40基因克隆及蛋白的原核表达和纯化

目的通过基因工程手段从大鼠脊髓中获取Nogo-66、NEP1-40基因并实现其蛋白的体外表达。方法从幼年大鼠的脊髓组织中,通过RT-PCR技术获得Nogo-66、NEP1-40基因,将目的基因通过基因连接反应与T载体连接,重组质粒进行基因序列测序,构建PQE30-GST和目的基因的高表达质粒,异丙基-β-D-硫代半乳糖(isopropy-lthiogalactoside,IPTG)诱导表达,Ni柱纯化,Western-blot法检测纯化的目的蛋白。结果成功获得大鼠Nogo-66、NEP1-40基因,加上两端的酶切位点和保护性碱基,大小分别为215bp和137bp。序列测序显示基因突变率为0,表达质粒构建双酶切(BamH和Hind)可见目的基因的条带,经IPTG诱导表达,获得带GST标签的融合蛋白Nogo-66和NEP1-40,相对分子质量分别为33.2×103和30.3×103。蛋白纯化结果理想,经Western-blot分析证实抗原性正确。结论Nogo-66、NEP1-40蛋白可通过基因工程手段获得体外高效表达,这将对其功能的研究及脊髓损伤疫苗的研究提供基础。

甲型流感病毒纯化及病毒生物学特征分析

目的评价蔗糖密度梯度离心纯化甲型流感病毒的方法,并对纯化的病毒颗粒特征和免疫原性进行分析。方法接种鸡胚培养病毒,收获尿囊液,超速离心浓缩,蔗糖密度梯度离心纯化病毒,用血凝试验、蛋白定量、透射电镜和SDS-PAGE鉴定病毒颗粒。取病毒纯化产物以0.03mg/只和0.005mg/只分组免疫小鼠,采集小鼠血清,利用血凝抑制试验测定血清血凝抑制滴度。结果成功利用蔗糖密度梯度离心法纯化出流感病毒,病毒原液经纯化后被分离成L、M、H三个病毒带,其中M病毒带的吸光度、蛋白浓度及血凝滴度最高,蛋白浓度可达1.2mg/mL,血凝滴度高达1×49。电镜观察显示,L区带为具有血凝活性的质膜和结构疏松的病毒组成,M区带病毒颗粒呈球形、丝状或棒状。同时,有大量空心病毒颗粒存在。H区带与M区带类似,但未发现空心病毒颗粒。纯化的病毒免疫小鼠后可产生具有较高血凝抑制活性的抗体。结论蔗糖密度梯度离心技术可用于流感病毒抗原的制备,且不影响病毒的免疫原性。因此,密度梯度离心法可为流感病毒的基础研究及疫苗开发提供技术支持。

消化性溃疡患者幽门螺杆菌cagA基因检测与分析

目的 建立扩增幽门螺杆菌（Hp）cagA基因的高特异性方法,结合生物信息学方法分析并阐明cagA基因结构特点及地域起源特征。方法 在GenBank检索并下载cagA目标基因序列,设计引物。从消化性溃疡患者胃黏膜组织中提取总RNA,逆转录为cDNA,分段、多轮PCR扩增目的基因,ABI3500xl测序仪测定PCR产物核酸序列,ATCG基因分析软件拼接基因序列,ClustalX1.8序列分析软件比对参考序列和患者PCR扩增产物序列,Bioedit及Megalign基因软件分析核苷酸序列同源性,Mega4.1基因软件对分析序列构建进化树。结果 24例胃溃疡患者中有4例胃黏膜扩增出cagA基因片段。20例十二指肠溃疡患者中有2例胃黏膜扩增出cagA基因,均成功测序,命名为XA-cagA2-2。与本研究中目的基因同源性较高（同源性91.8%~97.0%）的菌株来源于泰国-菲律宾岛、日本冲绳岛人群菌株,进化关系较近的为泰国-菲律宾岛菌株、秘鲁亚马逊河的美国印第安人菌株以及日本冲绳岛菌株。结论 本研究建立的方法成功扩增出cagA目的基因全长序列,成功进行测序、同源性分析和进化树分析,为陕西省Hp cagA基因多态性及地域性特征研究提供理论基础。