三甲双酮对斑马鱼胚胎早期发育的影响

针对抗癫痫药物的临床神经性毒副作用及致畸性,以三甲双酮为探针药建立了抗癫痫药毒性的斑马鱼胚胎模型。结果显示,斑马鱼胚胎暴露于三甲双酮后出现浓度依赖性的畸形和死亡。畸形表型有生长迟缓,脑区、眼和听囊变小,半规管和耳石受损,以及心血管系统异常。这些表型与临床病例和文献报道很相似。毛细胞染色显示听囊ML2神经丘毛细胞数明显减少。原位杂交检测发现脑标志基因zic1和xb51、自噬基因atg5的表达图式发生了异常变化。RT-PCR检测显示听觉基因val和hmx2的表达水平也发生了异常变化。这些结果提示脑组织和控制身体平衡及听力的神经感受器是三甲双酮的主要毒性靶位。斑马鱼胚胎和幼体可以模拟三甲双酮对哺乳动物的致畸和神经毒性反应。

HCV非结构蛋白NS5A基因的斑马鱼肝脏表达模型

目的建立HCV非结构蛋白NS5A基因在斑马鱼肝脏特异表达的模型,研究HCV NS5A的体内作用机制并初步探讨HCVNS5A对肝病理标志基因表达的影响。方法克隆肝基因表达调控序列——斑马鱼脂肪酸结合蛋白基因增强子序列(eFABP)和HCV非结构蛋白基因NS5A序列,利用CMV启动子序列,构建HCV NS5A基因和报告基因绿色荧光蛋白基因eGFP在肝脏共表达的基因构件pFC-5AiR。经细胞转染实验验证所建构件的报告基因DsRed表达红色荧光蛋白后,将该基因构件线性化并经显微注射导入斑马鱼胚胎;通过荧光显微镜观察和整体原位杂交技术对目的基因NS5A的表达进行定位,验证其肝脏特异性表达。采用RT-PCR方法和westernblot方法对HCVNS5A基因的转录和翻译水平进行检测;并检测肝脏病理相关的标志基因的转录水平变化。结果细胞转染实验证明基因构件pFC-5AiR的报告基因DsRed能够在肝癌细胞Huh7中表达;斑马鱼胚胎注射该基因构件后在肝脏能够观察到红色荧光蛋白基因DsRed的表达;RT-PCR和western blot结果显示HCV基因NS5A能够在斑马鱼体内正确表达;原位杂交结果进一步证明了NS5A的表达集中在斑马鱼肝脏内。进一步RT-PCR检测表明HCVNS5A在斑马鱼体内的表达可导致一些肝代谢和纤维化相关基因的上调,如Adiponectin、LDLR、Argsyn、TGF-β和HMGR等,推测NS5A在肝脏脂肪病变和纤维化中具有一定作用。结论成功建立了斑马鱼肝脏表达HCVNS5A的模型;初步数据表明HCVNS5A在斑马鱼体内的表达与部分肝代谢和纤维化标志基因的异常表达相关;该模型可以用于HCVNS5A的体内病理机制的研究。

17α-乙炔雌二醇对斑马鱼胚胎发育的致畸作用及其基因靶位

随着炔雌二醇临床适用范围的扩大和畜牧渔业中的滥用所导致的环境污染,使得建立准确、简便、快速的体内检测方法和开展对雌二醇的胚胎发育毒理研究愈显重要。本文以17α-乙炔雌二醇(17α-ethynylestradiol,EE2)为代表化合物,利用模式动物斑马鱼研究了EE2的致畸性、靶组织和靶基因及其对胚胎心律的影响。结果表明,EE2的半数致畸浓度(TC50)为0.8μg.mL-1,半数致死浓度(LD50)为3.3μg.mL-1;其致畸靶位涉及脑和眼、心、肌肉、骨骼、色素和内脏。EE2可导致胚胎心率异常。胚胎对EE2敏感期主要在器官形成期之前,且具有时间积累效应。RT-PCR结果显示,EE2可抑制头部发育基因如boz,促进躯干和尾部发育的基因如ntl、spt和成形素shh基因,干扰多功能的Nodal信号基因cyc、sqt和oep。本研究利用斑马鱼建立了快速、有效体内检测炔雌二醇类化合物胚胎毒性的方法。

氨基糖苷类药物耳毒性的斑马鱼模型的研究

氨基糖苷类抗生素因其抗菌谱广、抗菌能力强,半个多世纪以来一直是临床上常用的抗菌素之一。但氨基糖苷类抗生素具有很强的耳毒和肾毒作用,在药物致聋因素中排在首位。本研究以庆大霉素(gentamycin)、新霉素(neomycin)、链霉素(streptomycin)等3种氨基糖苷类抗生素为代表性药物,研究其对斑马鱼胚胎发育的毒性作用和对幼体毛细胞的损伤作用,并探索了该损伤与听觉相关基因之间的联系。结果显示:①3种药物的致死作用都具有明显的浓度依赖性,其致死作用的强弱顺序为链霉素>新霉素>庆大霉素;②3种药物处理的5 dpf(day past fertilization)幼体出现身体失衡及体位异常,以及耳囊结构的异常变化;③毛细胞染色实验可观察到,3种药物作用的毛细胞和神经丘均出现明显的损伤和数量减少;④与听觉器官发育相关的基因eya1、val、otx2、dlx6a均随3种抗生素药物浓度的升高,出现差异性的表达水平下调。本研究首次探索了这3种耳毒性氨基糖苷类抗生素处理与斑马鱼听囊结构和听觉基因表达的相关性;并证明利用斑马鱼建立简便、准确、直观、快速地检测药物耳毒性的模型和检测方法的可行性。

非洛地平及其片剂的杂质研究

系统研究非洛地平及其片剂的杂质,完善质量标准对有关物质的控制。采用HPLC-DAD、UPLC-MS、IR和NMR等方法对非洛地平及其片剂中的杂质进行分离、鉴定,并利用斑马鱼模式动物分析杂质的毒性。由非洛地平以及片剂中分离鉴定了3种杂质,分别为杂质1(2,6-二甲基-4-(2,3-二氯苯基)-1,4-二氢-3,5-吡啶二甲酸二甲酯),杂质2(2,6-二甲基-4-(2,3-二氯苯基)-3,5-吡啶二甲酸甲乙酯)和杂质3(2,6-二甲基-4-(2,3-二氯苯基)-1,4-二氢-3,5-吡啶二甲酸二乙酯)。斑马鱼模式动物分析4种化合物的致畸作用依次为:杂质3≥非洛地平>杂质1>杂质2;致死作用依次为:杂质2=杂质3>非洛地平≥杂质1。本研究确证了非洛地平的3种杂质,并对杂质进行了毒性研究,提出了标准修订建议,为生产过程中杂质的控制提供了有力的数据支持。

高通量测序技术与传统染色体核型分析技术在稽留流产遗传学分析中的比较

目的比较传统染色体核型分析技术和高通量测序技术在稽留流产遗传学分析中的应用,探讨高通量测序在临床遗传学分析中的价值。方法采用绒毛细胞培养及染色体核型分析检测稽留流产绒毛组织1530例;采用高通量测序和生物信息分析技术检测稽留流产绒毛组织例。比较两种方法的一致性及差异。结果 (1)传统染色体核型分析技术:1530例稽留流产绒毛培养成功率为93.5%(1431/1530);在1431例核型分析结果中,染色体正常占44.4%(636/1431);染色体数目异常占53.9%(771/1431)(其中含嵌合体29例);染色体结构异常占1.7%(24/1431)。(2)高通量测序技术:25例稽留流产绒毛样本全部检测成功,成功率100%;染色体正常占28%(7/25);染色体数目异常占56%(14/25)。染色体结构异常(染色体片段的缺失和重复)占16%(4/25)。(3)通过两种检测方法的比较,发现高通量测序技术具有更高的染色体结构异常检出率。结论高通量测序技术用于诊断稽留流产绒毛组织是可行的,与传统染色体核型分析技术相比成功率高,且对染色体结构异常的诊断有较高的敏感性,可以作为传统染色体核型分析技术的补充方法。