二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体的构建及原核表达

目的构建二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并进行表达和鉴定。方法采用PCR定点突变的方法,构建含二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体突变基因质粒pUC57-d41,BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,定向插入pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用SDS-PAGE、Western blot鉴定表达产物。对目的蛋白进行纯化和复性,并进行抗原结合活性及相对稳定性检测。结果重组载体pET-d41经酶切鉴定,证实构建正确。表达产物相对分子质量约为28000,与理论预期值完全相符。目的蛋白最高表达量可占菌体总蛋白的45.48%。经Ni-NTA亲和层析法纯化并复性后,蛋白纯度达95%以上,抗HIV-1 gp41 dsFv具有抗原结合活性,稳定性优于scFv。结论已成功构建了二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并获得表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

抗HIV-1外膜蛋白单链抗体基因的酵母表达和生物活性分析

目的:构建含抗HIV-1外膜蛋白gp120单链抗体(scFv)基因的酵母表达载体,实现目的蛋白的分泌性表达,并检测其生物活性。方法:采用基因工程和重组DNA技术,从质粒pET28-scFv中切下目的基因片段,定向克隆入毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9的相应位点,构建重组酵母表达质粒pPIC9-scFv。BglⅡ线性化后,电转化入受体酵母菌GS115中,筛选阳性重组子,进行甲醇诱导表达,并用RT-PCR、SDS-PAGE、双抗体夹心Dot-ELISA法分析目的蛋白表达情况。结果:通过表型筛选、PCR鉴定获得阳性重组酵母工程菌,RT-PCR、SDS-PAGE分析表明目的蛋白得到很好表达,表达量可占培养液上清总蛋白量的18%,双抗体夹心Dot-ELISA法检测,表达产物能够特异识别重组HIV-1gp120抗原蛋白并与之发生特异性免疫反应,证明表达的重组scFv具有良好的抗体活性。结论:成功地实现了scFv基因的分泌性表达,为抗AIDS靶向治疗及进一步研究其抗HIV活性提供了依据。

抗HIV-1 gp120单链抗体和白喉毒素融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建人源抗HIV-1单链抗体和白喉毒素融合基因的原核表达质粒,并诱导其在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法通过PCR扩增,获得目前应用较多的DAB389基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot方法分析鉴定。结果酶切及DNA序列测定鉴定正确。SDS-PAGE和West-ern Blot分析证实,重组质粒可表达出相对分子质量为75200的蛋白,与DT-hs120融合基因分子量一致,其表达量约占菌体总蛋白的21%,表达形式主要为包涵体。结论成功构建了DT-hS120表达载体,并获得了高效表达。

表达中国流行株HIV-1 gp120外膜蛋白靶细胞模型的建立

利用pDispaly真核表达载体构建了用于表达中国流行株HIV-1gp120的真核表达质粒pD-120,通过脂质体转染法将其导入人宫颈癌细胞(HeLa),经G418反复加压筛选,直到细胞不再死亡为止,8代后获得稳定表达中国流行株HIV-1gp120蛋白的靶细胞复制模型HeLa-gp,SDS-PAGE,蛋白印迹与间接免疫荧光分析表明,重组蛋白得到很好表达,并具有良好生物活性,为抗AIDS/HIV治疗用基因工程制剂或靶向药物的活性检测奠定了坚实基础。

新型抗病毒蛋白2CVN融合基因的构建、表达与纯化

目的构建新型抗病毒蛋白2CVN融合基因,增强CVN对病毒的结合性及中和活性,为进一步研究抗病毒药物奠定基础。方法采用PCR法,以pBluescriptⅡSK(+)-CVN质粒为模板,扩增CVN片段,在引物中引入Linker序列,将扩增的CVN片段与载体pET-CVN连接,构建pET-2CVN原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),进行表达及产物纯化。结果表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析,相对分子质量为29000,与理论预期值完全相符。凝胶成像分析表明目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的31.48%,纯化后的目的蛋白纯度达95%以上。结论已成功构建了2CVN融合基因,并获得高效表达。

抗AIDS新型导向毒素CVN-LP1融合基因的构建及原核表达

目的:构建重组抗病毒融合蛋白CVN-LP1原核表达载体,并进行表达和鉴定。方法:将已经构建好的pET-CVN和pET-LP1重组质粒,EcoRI和HindⅢ同时进行双酶切,保留LP1片段前端的linker序列。将所得的CVN片段连入pET-LP1载体上,构建pET-CVN-LP1融合表达载体,转化入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western-blot鉴定表达产物。结果:重组载体pET-28a(+)-CVN-LP1经PCR及XhoI/EcoRI和EcoRI/HindIII双酶切鉴定,证实构建成功。将其转化入大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物相对分子量约为20kDa,与理论大小一致。凝胶成像分析表明最高表达量可占菌体总蛋白的49.58%。SDS-PAGE、Western-blot分析表明目的蛋白得到了很好的表达。结论:构建了pET-CVN-LP1原核表达载体,并得到了目的融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了坚实的基础。

抗HIV-1白喉免疫毒素的构建及原核表达

目的:构建重组DTA-hS120融合基因表达载体,并诱导其在大肠杆菌中表达。方法:通过PCR扩增,获得只含白喉毒素(DT)活性部位(DTA)的基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western印迹分析鉴定。结果:酶切及DNA序列测定鉴定质粒构建正确;SDS-PAGE和Western印迹分析证实,可表达出相对分子质量为54000的融合蛋白,与DTA-hS120融合蛋白的分子量一致;经凝胶成像分析,其表达量约占菌体总蛋白的23%,表达形式主要为包涵体。结论:构建了DTA-hS120重组表达质粒,并获得了高效表达,为进一步研究抗HIV-1治疗药物奠定了基础。

基于SFVRNA复制子核酸疫苗pIRSFV-HN的构建及其体内外抑瘤作用

目的:构建基于塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus,SFV)RNA复制子和新城疫病毒HN基因的核酸疫苗pIRSFV-HN,并探讨其体内外的抑瘤作用。方法:基于SFV RNA复制子和新城疫病毒HN基因构建核酸疫苗pIRSFV-HN,pIRSFV-HN转染人结肠癌细胞HCT-116,以Western blotting检测转染后HCT-116细胞HN的表达水平,以AO/EB双荧光染色检测肿瘤细胞的凋亡,以MTT法检测疫苗对HCT-116细胞增殖的抑制。构建C57BL/6小鼠右后肢皮下荷H22腹水瘤细胞模型,瘤体内注射pIRSFV-HN(共3次),检测该小鼠血清IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ水平和特异性CTL活性。结果:成功构建基于SFV RNA复制子和新城疫病毒HN基因的核酸疫苗pIRSFV-HN。结肠癌细胞HCT-116被疫苗转染后可有效表达HN蛋白,对照细胞则无表达;转染后HCT-116细胞出现凋亡的征象;该细胞的增殖受到明显抑制,最大抑制率达55.34%。移植瘤体内注射疫苗后,荷瘤小鼠血清IL-2、IFN-γ水平显著升高(P<0.05),其CTL活性也显著升高(P<0.01)。结论:基于SFVRNA复制子和新城疫病毒HN基因的核酸疫苗pIRSFV-HN在体外可有效地抑制肿瘤细胞;在体内可促使免疫趋向Th1优势,提高其抑瘤免疫水平。