四种诱导剂诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:不同诱导剂诱导骨髓间充质干细胞分化形成心肌样细胞功能学方面的研究未见报道。目的:观察5-氮杂胞苷、血管紧张素Ⅱ、骨形态发生蛋白2和P53特异性抑制剂对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响。方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞分为5组,即正常对照组,5-氮杂胞苷组、血管紧张素Ⅱ组、骨形态发生蛋白2组和P53特异性抑制剂组。采用流式细胞仪技术鉴定骨髓间充质干细胞表面特定抗原表达情况,Western blot法检测诱导4周后Cx43、肌钙蛋白Ⅰ表达情况,fluo3/AM钙离子探针激光共聚焦检测诱导4周后钙瞬变能力。结果与结论:骨髓间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD45的阳性表达率分别为89.1%,90.4%和1.9%。Western blot结果显示,各诱导组均有肌钙蛋白Ⅰ的表达,P53特异性抑制剂组较其余各组表达多(P<0.05),骨形态发生蛋白2组较其余各组表达少(P<0.05)。Cx43蛋白在各组之间均有表达,正常对照组较各实验组明显较少(P<0.05),P53特异性抑制剂组较其余各组表达多(P<0.05),血管紧张素Ⅱ组较其余各组表达少(P<0.05)。钙瞬变功能测定结果显示,荧光强度血管紧张素Ⅱ>P53特异性抑制剂>5氮杂胞苷>骨形态发生蛋白2>正常对照组(P<0.01)。提示不同诱导剂诱导骨髓间充质干细胞之后,各实验组均能向心肌样细胞分化,表达心肌特异性蛋白。而不同诱导剂发挥作用的通路不同,从而对诱导骨髓间充质干细胞分化形成心肌样细胞的功能产生不同影响。

miR-17-5p在不同代骨髓间充质干细胞中的表达

目的:观测miR-17-5p在年轻的和衰老骨髓间充质干细胞(BMMSCs)中的表达,并分析其与细胞衰老的相关性。方法:采用密度梯度离心法分离大鼠BMMSCs并培养至第10代。取第4代(P4)BMMSCs和第10代(P10)BMMSCs的用细胞衰老β-半乳糖苷酶(β-gal)染色法进行染色。采用实时定量PCR检测P4及P10 BMMSCs中miR-17-5p基因的表达,并用2(-ΔΔct)法定量分析。结果:①形态学改变:P4～P10的细胞形态发生改变,P4的细胞形态均一,呈典型的漩涡状生长,P10的细胞失去典型的梭形外观,细胞体积增大而不规则,形状扁平破碎,细胞间隙增大,出现凋亡。②β-gal染色结果:P10的细胞肥大、染呈蓝色(呈阳性),P4的细胞染色后未着色(呈阴性)。③实时定量PCR检测结果:P4细胞miR-17-5p基因的表达量是P10细胞的6.5倍(P<0.01)。结论:衰老BMMSCs中miR-17-5p的表达量显著降低,提示miR-17-5p可能参与了细胞的衰老过程。

人心脏干细胞向心肌细胞分化的研究

研究了5-AZA、Ang II及其联合诱导人心脏干细胞向心肌细胞分化和提高分化率的方法。经患者或家属同意,从心外科手术中获取人心脏右心耳组织,Ⅱ型胶原酶消化、培养、传代,选用P2-P8细胞与心脏干细胞抗体CD117（c-kit）结合后,经流式细胞仪无菌分选纯化心脏干细胞,对分选纯化后的c-kit＋CSCs进行培养（见前期试验）。选取无菌分选纯化后c-kit＋CSCs进行诱导、分化实验。实验随机分为四组：对照组（普通心脏干细胞培养液）、5-AZA诱导组、Ang II诱导组、5-AZA和Ang II联合诱导组。4周后用Western Blotting测定心肌细胞特异性蛋白c Tn I、Cx43的表达;用流式细胞仪测定各组心肌细胞分化率。人心脏干细胞诱导4周后,Western blotting结果显示,四组均有c Tn I、Cx43表达,对照组表达最弱,5-AZA和Ang II联合组表达最强。人心脏干细胞诱导4周后流式细胞仪测定各组心肌细胞分化率,统计结果显示：对照组（27.86±4.52）%、5-AZA组（52.71±7.40）%、Ang II组（40.48±7.02）%、5-AZA和Ang II联合组（64.74±6.11）%;四组间均有统计学差异（P〈0.05）。5-AZA、Ang II均能诱导人c-kit＋CSCs分化为心肌细胞,5-AZA和Ang II联合诱导的心肌细胞分化率高于5-AZA、Ang II单独诱导方案。

自体心脏干细胞移植治疗缺血性心肌病的进展

背景:药物、介入或外科治疗均不能从根本上解决心脏缺血梗死后心肌细胞丧失问题。大量研究结果显示自体心脏干细胞移植治疗缺血性心肌病安全可行,可减少梗死瘢痕面积、改善心室重构、提高心脏功能。目前自体心脏干细胞移植治疗缺血性心肌病已进入临床试验阶段。目的:综述近年国内外自体心脏干细胞移植治疗缺血性心肌病的研究进展。方法:第一作者应用计算机检索1998年1月至2012年4月PubMed数据库、中国期刊全文数据库相关文章,英文检索词"autologous,cardiac stem cells,ischemic cardiomyopathy,transplantation,treatment";中文检索词"自体,心脏干细胞,缺血性心肌病,移植,治疗"。共检索到82篇相关文献,57篇文献符合纳入标准。结果与结论:经过大量小动物实验和大型动物的前临床实验准备阶段,目前自体心脏干细胞移植治疗缺血性心肌病已经进入临床试验阶段,初步临床试验结果显示自体心脏干细胞移植治疗缺血性心肌病安全、可行、有效。从心脏中分离的心脏干细胞移植到自体缺血梗死的心脏,可以分化生成心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞,抑制心室重构,改善心脏收缩、舒张功能。相对于其他来源的干细胞移植治疗,自体心脏干细胞移植治疗缺血性心肌病无免疫源性,不存在免疫排斥反应;不存在伦理问题;其趋向分化成心脏细胞系,成瘤率低,相对安全。自体心脏干细胞移植为缺血性心肌病的治疗提供了一条新的途径,有更高的临床应用价值。但目前开展的临床试验较少,观测时间不够长,缺少多中心大样本量的临床试验等,这些都需要进一步研究探索。

骨形态发生蛋白2与P53抑制剂PFT-α联合诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究

目的观察骨形态发生蛋白2(BMP-2)与P53抑制剂PFT-α体外联合诱导骨髓间充质干细胞(BMMSCs)定向分化为心肌样细胞的作用。方法采用密度梯度离心法分离大鼠BMMSCs,取第4代BMMSCs分四组诱导:(1)空白对照组,仅用完全培养基诱导;(2)骨形态发生蛋白2组(BMP-2,终浓度10μg/L);(3)P53抑制剂组(PFT-α,终浓度20μmol/L);(4)BMP-2联合PFT-α组(BMP-2+PFT-α,终浓度分别为10μg/L与20μmol/L)。24h后换为普通培养液继续培养4周。用倒置相差显微镜观察细胞的形态学改变,免疫细胞化学法鉴定诱导后心肌样细胞中心肌特异标志物性肌钙蛋白I(cTnI)的表达,流式计数法计算诱导后心肌样细胞诱导率。结果原代BMMSCs10d形成集落,呈星形或梭形。传代后细胞体积变大,诱导4周后细胞呈长梭形,生长趋于一致性,出现肌岛样结构。免疫细胞化学结果显示诱导4周后BMMSCs表达心肌特异性蛋白cTnI。流式计数法结果显示:空白对照组、BMP-2组、PFT-α、BMP-2联合PFT-α组心肌样细胞诱导率分别为(1.4±0.3)%、(17.1±1.2)%、(28.2±1.0)%、(39.9±1.7)%,BMP-2联合PFT-α组心肌样细胞诱导分化率高于BMP-2组与PFT-α组(P<0.01)。结论 BMP-2联合PFT-α可在体外诱导大鼠BMMSCs定向分化为心肌样细胞,其诱导分化率明显高于单纯BMP-2或单纯PFT-α诱导。

冠心病PCI术中/后风险和预后评估及临床意义

冠心病介入治疗(PCI)由于创伤小、疗效可靠、死亡率低和术后康复快等优点,已广泛用于冠心病的病因学治疗,并获得了非常好的近、远期预后[1]。随着介入治疗例数增加、手术难度提高和普及程度的拓广,各种手术并发症的发生率也逐渐增加,有的甚至危及患者的生命,因此术前充分评估患者的全身状况、术中和术后风险及近、远期预后是非常重要的。一、术中风险影响因素(一)全身因素全身一般状况与手术中发生各种并发症和危险的发生概率密切相关[2]。

骨形态蛋白2诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究

目的观察骨形态蛋白2体外诱导骨髓间充质干细胞(BMMSCs)定向分化为心肌样细胞的作用。方法采用密度梯度离心法分离大鼠BMMSCs,取第4代BMMSCs进行诱导:骨形态蛋白2组(BMP-2,终浓度为10μg/L),空白对照组。诱导24h后更换常规培养液继续培养4周。倒置相差显微镜观察细胞的形态学变化,免疫荧光染色法鉴定诱导后BMMSCs中心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)的表达,WesternBlot检测诱导2周和4周后Cx43以及cTnI的表达量,流式细胞计数法计算心肌样细胞诱导分化率。结果原代培养的BMMSCs2周形成集落,呈梭形或星形。传代细胞体积变大,诱导后细胞呈长梭形,呈一致性生长,并出现肌岛样结构。免疫荧光染色结果显示诱导后BMMSCs表达cTnI。WesternBlot检测结果提示诱导后Cx43以及cTnI均明显增多,4周组明显高于2周组。流式细胞计数法显示:BMP-2组心肌样细胞诱导率为(17.9±0.8)%。结论骨形态蛋白2可在体外诱导大鼠BMMSCs定向分化为心肌样细胞,其诱导分化率高。

Plenti6.3/V5-TERT慢病毒载体的构建并成功建立永生化大鼠骨髓间充质干细胞系的研究

目的为实现慢病毒感染后可用抗生素筛选TERT基因稳定整合的骨髓间充质干细胞,首先对pCI-neo-TERT质粒进行了改造和构建。方法将pCI-neo-TERT酶切后得到TERT片段,并进行PCR扩增,将得到的TERT片段连入Plenti6.3/V5,酶切鉴定载体构建正确后,将改造和构建载体分别与辅助质粒psPAX2、pMD2.G共转染HEK-293T包装细胞,收获病毒上清并感染靶细胞,使用相应抗生素筛选细胞,验证抗性基因的插入。结果成功构建了重组慢病毒载体Plenti6.3/V5-TERT,通过调整病毒上清的用量可以使靶细胞达到很高的感染效率;用相应抗生素筛选细胞证明了抗性基因的表达。结论我们成功构建了慢病毒载体Plenti6.3/V5-DEST-TERT,从而使病毒感染后用抗生素筛选稳定整合TERT的骨髓间充质干细胞成为可能。

人心脏干细胞提取技术的研究

目的研究体外分离、培养人左心耳c-kit+(CD117)心脏干细胞(c-kit+CSCs)的技术方法,为进一步研究心脏干细胞生物学特性、药物筛选和以后的临床应用提供技术支持。方法心脏手术中切取部分左心耳组织,经Ⅱ型胶原酶消化,接种培养、传代后进行流式细胞表面标志鉴定和无菌分选。结果通过单纯的酶消化方法可以成功地从人左心耳组织中分离出单个干细胞,流式细胞仪鉴定其表型为经典的心脏干细胞表型——c-kit+,多次传代后c-kit+持续高表达,无菌分选后可获得高纯度的c-kit+心脏干细胞。结论本研究技术可从人左心耳组织中分离培养出阳性率较高的c-kit+心脏干细胞,无菌分选后可获得高纯度的c-kit+心脏干细胞,进一步培养短期内可获得大量的用于实验和临床的c-kit+心脏干细胞。