基于蛋白质组学研究红花黄色素抗阿尔茨海默病的作用机制

目的研究发现红花黄色素(Safflower yellow,SY)对多种AD模型具有神经保护作用,但红花黄色素治疗AD的有效靶点和潜在分子机制尚不清楚。因此,通过建立Aβ1-42诱导的AD模型大鼠并给予SY治疗,探究SY抗AD的作用机制。方法Morris水迷宫实验观察SY对AD模型大鼠学习记忆缺失的改善作用;Golgi染色明确SY对AD模型大鼠脑组织海马区树突棘形态的影响;定量蛋白质组方法用于鉴定和量化各组大鼠海马中的蛋白质并通过生物信息学分析差异表达蛋白。结果SY能显著提高AD模型大鼠的学习记忆能力,改善树突棘的形态学损伤。蛋白质组学分析结果显示,Mvd、Map6d1和Rpl34作为两个比较组的3种重要的差异蛋白,与AD的发病机制密切相关,Western Blot的结果与蛋白质组学分析结果一致。结论(1)“核糖体”和“补体和凝血级联反应”可能参与了Aβ1-42诱导的神经损伤;(2)Rpl34,Mvd和Map6d1可能是SY抗AD的的关键分子靶标;(3)SY可能通过影响“ECM-受体相互作用”而发挥神经保护作用。

京尼平苷酸对APP/PS1小鼠学习记忆能力及脑内淀粉样蛋白沉积的影响

目的探讨京尼平苷酸(GPA)对阿尔茨海默病转基因小鼠学习记忆能力的影响及对脑内淀粉样蛋白沉积的作用及机制。方法APP/PS1转基因小鼠随机分为转基因组、GPA 25,50,75 mg/kg组及多奈哌齐组。C57BL/6小鼠为野生组。灌胃给药90 d后,通过Morris水迷宫实验评价痴呆小鼠的学习记忆能力。硫黄素-T染色检测小鼠脑组织内硫黄素-T阳性斑块的沉积。Western Blot法检测小鼠大脑皮层及海马内BACE及IDE蛋白水平。ELISA法检测小鼠大脑皮层及海马内IL-1β,IL-6,IL-4,TNF-α的水平。结果与野生组比较,转基因小鼠潜伏期明显增加,穿越平台次数明显减少(P<0.05),脑内Th-T斑块百分面积显著增多(P<0.01),IDE的蛋白水平显著降低且BACE的蛋白水平显著升高(P<0.01),IL-1β,IL-6和TNF-α含量均显著升高,IL-4含量显著降低(P<0.01)。与转基因小鼠比较,GPA 75 mg/kg剂量组转基因小鼠潜伏期明显缩短,穿越平台次数明显增多(P<0.05),GPA处理组小鼠脑内Th-T荧光面积百分比显著减少,IDE水平显著升高,BACE水平显著降低(P<0.01),GPA 50,75 mg/kg组小鼠脑内IL-1β,IL-6和TNF-α含量均显著降低(P<0.01或P<0.05),GPA 50 mg/kg明显升高小鼠皮层IL-4含量(P<0.05)。结论京尼平苷酸可通过影响Aβ的生成和降解两方面调控小鼠脑内Aβ水平,减轻转基因小鼠的神经炎症,发挥神经保护作用。

丙烯醛体内外诱导神经元铁死亡的初步研究

【目的】探究丙烯醛是否能够诱发体内外发生铁死亡现象。【方法】体外:给予小鼠海马神经元细胞系HT22细胞丙烯醛进行造模,采用铁死亡抑制剂铁抑素-1(Fer-1)与去铁胺(DFO)进行保护。MTT法检测细胞存活率;自由基探针二氢乙啶(DHE)与亚铁探针FerroOrange检测细胞内自由基与亚铁离子含量;透射电镜观察正常与模型组的线粒体超微形态与结构;Westernblot法检测铁死亡相关蛋白表达的情况。体内:雄性C57BL/6小鼠,7~8周龄每日给予3 mg/kg的丙烯醛分别进行造模1、2、4周,并对海马区域进行Westernblot法检测铁死亡相关蛋白表达的情况。【结果】丙烯醛显著降低HT22细胞的存活率,并诱导线粒体皱缩和嵴数目减少。同时丙烯醛可显著增加细胞内自由基与亚铁离子。此外,在细胞水平丙烯醛促进环氧化酶2(COX-2)、铁蛋白重链1(FTH1)表达上升,谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)表达减少;在动物水平丙烯醛促进COX-2表达上升,GPX4、FTH1表达减少。【结论】丙烯醛可在体内外诱导神经元发生铁死亡现象,提示铁死亡抑制剂可以用来缓解与丙烯醛有关的中枢神经系统疾病,如阿尔兹海默病。

星形胶质细胞调控下红花黄色素对Aβ1-42介导的海马神经元突触损伤的保护作用研究

目的探讨星形胶质细胞存在下红花黄色素对Aβ1-42诱导的神经元突触损伤的保护作用。方法采用Aβ1-42损伤海马神经元模拟体外AD,不同浓度(0.01、0.1、1g/L)红花黄色素进行干预,MTT法测定细胞存活率选择最佳浓度。建立纯化海马神经元培养体系(NE-S)和星形胶质细胞和神经元共混合培养体系(MIX-S),两种培养体系分别设立正常对照组、Aβ1-42(15μmol/L)模型组、红花黄色素给药组。倒置显微镜下观察细胞形态;WesternBlot检测神经元内SAP102蛋白表达水平。结果(1)红花黄色素(0.01、0.1、1g/L)能够显著提高神经元的存活率,且具有剂量依赖性;(2)神经元形态结果显示在MIX-S的模型组中神经元突触萎缩状态较NE-S的模型组稍微有所改善。红花黄色素(1g/L)能明显改善NE-S和MIX-S中的神经元突触萎缩状态,但NE-S和MIX-S中的红花黄色素1g/L给药组神经元形态没有差异性;(3)WesternBlot结果显示在MIX-S的模型组中SAP102蛋白表达较NE-S的模型组有所增加。在NE-S和MIX-S中的红花黄色素1g/L给药组SAP102蛋白表达都明显上调,但NE-S和MIX-S中的红花黄色素1g/L给药组SAP102蛋白含量没有差异性。结论星形胶质细胞的存在可增加Aβ1-42损伤的神经元突触蛋白的表达,但并不提高SY对神经元突触损伤的保护作用。

PT109改善链脲佐菌素诱导的散发性阿尔茨海默病小鼠认知功能障碍的作用及机制

【目的】观察PT109能否改善侧脑室注射链脲佐菌素(icv-STZ)诱导的散发性AD小鼠模型的认知功能障碍并对其机制进行初步探讨。【方法】32只7周龄雄性C57BL/6小鼠分为正常组(7只)、模型组(7只)、PT109低剂量组(9只)、PT109高剂量组(9只)。将STZ于第1和3天注射入小鼠侧脑室建立散发性阿尔茨海默病小鼠模型;(3mg/kg,每个注射位点5μL)造模后,分别腹腔注射PT109(30、100 mg·kg^(-1)·d^(-1)),2周后通过Morris水迷宫和避暗实验评价小鼠学习记忆能力;随后通过免疫荧光、免疫组化、免疫印迹、高尔基染色等方法检测小胶质细胞、神经元、树突棘、磷酸化Tau蛋白等AD相关指标。【结果】行为学实验结果显示:PT109可改善icv-STZ小鼠的学习记忆障碍;免疫荧光及组化结果显示:与模型组相比,PT109减少海马区域Iba1阳性细胞数量(低剂量:P<0.001,高剂量:P<0.001),高剂量PT109增加海马和皮层区域MAP2和Tuj1阳性细胞总数量(P<0.05,P<0.01),差异具有统计学意义。高尔基染色结果显示:与模型组相比,PT109增加树突棘密度(低剂量:P<0.001,高剂量:P<0.001),差异具有统计学意义。免疫印迹实验结果表明:与模型组相比,PT109降低NLRP3(高剂量:P<0.05)、磷酸化Tau蛋白的表达水平(低剂量:P<0.05,高剂量:P<0.01),高剂量PT109提高PSD95(P<0.05)、磷酸化GSK3β(P<0.05)的表达水平,差异具有统计学差异。【结论】PT109可改善icv-STZ诱导的小鼠学习记忆障碍,可能与调节GSK3β/Tau相关通路有关。

红花黄色素对APP/PS 1双转基因小鼠脑组织中胶质细胞活化及炎症因子释放的影响

目的:探讨红花黄色素(SY)对阿尔茨海默病(Alzheimer's disease AD)转基因小鼠学习记忆能力的影响及其对脑组织中胶质细胞活化和炎症因子释放的影响。方法:选用6月龄APP/PS 1双转基因小鼠60只,随机分成5组:转基因组、多奈哌齐组(0.75 mg/kg)、红花黄色素10、30、100 mg/kg剂量组,同月龄野生型C57BL/6小鼠12只作为对照组,其中转基因组与对照组灌胃相应体积的生理盐水。连续3个月灌胃给予相应药物治疗后,进行Morris水迷宫实验。采用免疫组织化学法检测GFAP及CD45的表达,ELISA试剂盒测定各组小鼠皮层中IL-6、IL-8及TNF-α的表达。结果:与野生型小鼠相比,转基因组小鼠空间学习记忆能力明显下降,皮层及海马CA1、CA3、DG区的CD45、GFAP表达水平均增高,皮层组织中TNF-α、IL-6、IL-8水平显著增加。经红花黄色素治疗后,红花黄色素10、30、100 mg/kg剂量组学习记忆能力显著改善,其对GFAP、CD45、IL-6、IL-8及TNF-α的表达具有显著降低的作用;红花黄色素100 mg/kg剂量组对转基因小鼠海马各区CD45、皮层及海马部位GFAP以及皮层IL-6、IL-8的表达均有显著降低的作用;红花黄色素10 mg/kg剂量组对小鼠大脑海马CA1、CA3及皮层部位的CD45、海马及皮层部位的GFAP、皮层IL-8的表达有显著降低的作用。结论:红花黄色素可以提高痴呆小鼠的学习记忆能力,同时可抑制脑组织胶质细胞活化,减轻皮层组织炎症损伤。

红花黄色素对Aβ_(1-42)诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用研究

目的:探讨红花黄色素对Aβ_(1-42)诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及其机制。方法:采用Aβ_(1-42)损伤SH-SY5Y细胞模拟体外AD,不同浓度(0. 01、0. 1、1g/l)红花黄色素进行干预。倒置显微镜下观察细胞形态; MTT法测定细胞存活率;酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞内Aβ_(1-42)水平; Western Blot检测SH-SY5Y细胞内APP、BACE-1、SAPPα、NEP、IDE、ERK和P-ERK蛋白表达水平。结果:红花黄色素各剂量均能够减少Aβ_(1-42)引起的SH-SY5Y细胞的损伤,使细胞的存活率显著提高,且具有剂量依赖性;ELISA结果显示,红花黄色素0. 1、1g/L可降低SH-SY5Y细胞内的Aβ_(1-42)水平; Western Blot结果显示红花黄色素各剂量均可以上调SAPPα、NEP、IDE和P-ERK蛋白的表达,下调APP和BACE-1蛋白的表达。结论:红花黄色素可以通过调节Aβ_(1-42)相关代谢酶而减少Aβ_(1-42)的含量,发挥抗AD作用,该作用可能与MAPK/ERK通路的激活有关。