旋毛虫鸟氨酸脱羧酶对旋毛虫抗酸能力调控的研究

为探究旋毛虫体内是否存在鸟氨酸依赖性抗酸系统(AR5)及旋毛虫鸟氨酸脱羧酶(TsODC)对旋毛虫抗酸能力的调控作用,本实验分别采用p H1.5、p H2.5、p H4.5、p H6.6的培养液以及PBS(pH7.4)作为对照组分别培养0.5 h、1 h和2 h后,通过统计旋毛虫肌幼虫的存活率、采用荧光定量PCR(qPCR)和western blot,分别筛选旋毛虫肌幼虫体外最适酸处理条件。结果显示,在酸度为p H2.5培养2 h时,肌幼虫的存活率为51%(此时死亡数与存活数基本相等)及Ts ODC基因的转录和表达水平最高。因此,p H2.5培养2 h为旋毛虫肌幼虫体外最佳酸处理条件。于培养液中分别添加不同浓度的精氨酸、Ts ODC多抗血清、姜黄素和雷帕霉素,以PBS作为对照组分别培养12 h、24 h和48 h后,采用上述最佳酸处理条件处理后,通过计算肌幼虫存活率,采用q PCR检测Ts ODC基因的转录水平并初步筛选不同制剂的最佳培养浓度及时间,并在各最佳浓度和时间培养后,再经最佳酸处理条件处理,采用western blot检测Ts ODC蛋白的表达,分析各制剂对旋毛虫抗酸能力的调控作用;从旋毛虫感染42 d的小鼠中收集肌幼虫并采集小鼠的膈肌,分别制备冰冻切片,采用间接免疫荧光试验(IFA)检测Ts ODC蛋白在肌幼虫中的分布。存活率结果显示,与PBS对照组相比,当添加浓度为10μg/mL的精氨酸培养24 h时,肌幼虫存活率提高27%,Ts ODC基因转录水平和蛋白表达水平分别提高83.3%和68%(P<0.01);当添加浓度为1 mg/mL的Ts ODC多抗血清、20μmol/L的姜黄素和2μmol/L的雷帕霉素均培养48 h时,肌幼虫存活率分别下降13%、18%和26%,Ts ODC基因转录水平分别降低24.1%、27.1%和37.7%(P<0.01)及其蛋白表达水平分别降低11.6%、25.8%(P<0.05)和47.8%(P<0.01)。IFA结果显示,绿色荧光信号主要出现在肌幼虫的表皮层、头部的唇乳突及尾部的生殖原基。上述结果表明,精氨酸可以通过上调Ts ODC基因的转录和表达水平提高旋毛虫的抗酸能力,而Ts ODC多抗血清、姜黄素和雷帕霉素则通过降低Ts ODC基因的转录和表达水平消弱旋毛虫的抗酸能力;Ts ODC可能是分泌蛋白且与旋毛虫的生长发育和繁殖有关。综上所述,本研究首次证实在旋毛虫肌幼虫中存在AR5,且其中的Ts ODC能够正调控旋毛虫的抗酸作用,为深入研究旋毛虫抗酸机制提供参考依据。

旋毛虫海藻糖酶(TsTRE)蛋白的表达及其间接ELISA抗体检测方法的建立

目的 以原核表达的旋毛虫海藻糖酶(Trichinella spiralis trehalase, TsTRE)重组蛋白作为检测抗原,建立间接ELISA抗体检测方法。方法 本实验采用RT-PCR技术扩增TsTRE基因,将其与pCold I表达质粒连接并于E.coli BL21感受态细胞中表达。应用亲和柱层析技术获得纯化rTsTRE,分别利用间接免疫荧光技术和Western-blot技术定位TsTRE和检测rTsTRE的免疫反应原性。与此同时,以rTsTRE蛋白为包被抗原建立间接ELISA抗体检测方法,并对其抗原包被浓度和待测血清稀释度、抗原包被条件、封闭液种类和封闭条件、酶标二抗稀释度和孵育条件、TMB显色时间等进行优化。确定该方法的临界值及评估该方法的重复性、敏感性、特异性和临床检出率等性能。结果 免疫荧光结果显示,在肌幼虫的杆状体、尾部和表皮等部位含有大量的海藻糖酶;Western-blot结果显示,rTsTRE可结合感染旋毛虫42 d小鼠的阳性血清且蛋白分子量约为60 kDa。建立的间接ELISA抗体检测方法的阳性临界值为0.384;批内和批间变异系数分别在5.504%~7.630%和4.664%~9.929%,且均不超过10%;最低检出效价为1∶1 280;与华支睾吸虫、血吸虫、猪蛔虫、猪弓形虫和弓首蛔虫抗体均无交叉反应,特异性较强;临床阴性检出率为0%。结论 本实验成功表达rTsTRE,以该蛋白为包被抗原建立的间接ELISA检测方法具有良好的重复性、敏感性、特异性和临床检测性,可应用于临床样本的检测。

siRNA-757干扰旋毛虫Ts-ODC基因对其抗酸能力的影响

旨在探究旋毛虫肌幼虫体内是否存在鸟氨酸依赖型抗酸系统,本研究根据GenBank中Ts-ODC全序列基因组设计三条特异性siRNA分子,采用脂质体浸染转染的方法将其分别转染至旋毛虫肌幼虫体内,使用qPCR、Western blot和间接免疫荧光试验,筛选最佳干扰siRNA分子及最佳干扰条件;并在pH 1.5、2.5、4.5和6.6的条件下将肌幼虫分别培养0.5、1和2 h,从肌幼虫Ts-ODC基因转录水平、酶活性及存活率等方面分析Ts-ODC基因干扰对旋毛虫肌幼虫抗酸能力的影响;将Ts-ODC基因被干扰的旋毛虫肌幼虫感染小鼠,在7和42 d时分别收集成虫和肌幼虫,分别计算其减虫率;将子一代肌幼虫在pH 2.5的酸性条件下培养2 h,计算其存活率,对Ts-ODC基因干扰的遗传性进行分析。结果显示,Ts-ODC siRNA-757为最佳干扰分子,转染12 h、浓度为2μmol·L^(-1)培养3 d时为最佳干扰条件;各组pH 2.5培养2 h时Ts-ODC基因转录水平最高,pH 1.5培养2 h时虫体的存活率明显低于其他培养条件(P<0.01),pH 4.5培养0.5 h时虫体体内酶活性最高;转染Ts-ODC siRNA-757的肌幼虫接种小鼠后,7 d时成虫和42 d时肌幼虫的减虫率分别为58.95%和65.91%;其子一代肌幼虫在pH 2.5的培养液内培养2 h时其存活率为49%。综上表明,旋毛虫肌幼虫体内具有鸟氨酸依赖型抗酸系统,本研究首次通过siRNA技术干扰旋毛虫肌幼虫Ts-ODC基因,且证实干扰Ts-ODC基因可降低肌幼虫抗酸能力,为后期旋毛虫病的防治提供新思路。

旋毛虫p53重组蛋白对血管内皮细胞通透性影响的研究

为研究旋毛虫p53蛋白对血管内皮细胞通透性影响的相关机制,本研究以人脐静脉内皮细胞(HUVES)为细胞模型,通过体外实验利用不同浓度的旋毛虫p53重组蛋白(Ts-p53)刺激HUVES,采用CCK-8试剂盒筛选Ts-p53刺激HUVES细胞的最适浓度,通过Transwell小室方法检测内皮细胞通透性,利用荧光定量PCR(qPCR)检测细胞凋亡关键因子Bax、Bcl-2以及内皮细胞间连接蛋白Zo-1及VE-cadherin转录水平的变化,利用western blot方法检测细胞凋亡关键因子Bax、Bcl-2、Cytochrome C、Pro-Caspase-9、cl-Caspase-9、Pro-Caspase-3、cl-Caspase-3以及内皮细胞间连接蛋白Zo-1及VE-cadherin蛋白表达量的变化。结果显示,Ts-p53刺激HUVES细胞的最适浓度为60μg/mL。随着Ts-p53对HUVES细胞作用时间的增加,FITC标记的白蛋白在感染3 h、6 h时内皮通透性Pa值逐渐上升,在12 h时尤为明显,并与空白对照组相比差异极显著(P<0.01),在刺激18 h时渗出指数下降。阳性对照组为LPS刺激HUVES,该组HUVES内皮通透性Pa值约为空白对照组HUVES的1.9倍(P<0.01)。表明Tsp53可以诱导HUVES通透性的增加。qPCR和western blot结果显示,与空白对照组相比,Ts-p53刺激3 h、6 h、12 h,Bax的转录水平和表达水平呈时间依赖性增加,在刺激12 h时其转录水平和表达水平最高(P<0.01),18 h时其转录水平和表达水平降低,阳性对照组Bax转录水平和表达水平极显著高于其他组(P<0.01)。与空白对照组比,Bcl-2的转录水平和表达水平呈时间依赖性减少,在刺激12 h时其转录水平和表达水平最低(P<0.01),18 h时其转录水平和表达水平均增加,阳性对照组Bcl-2转录水平和表达水平均低于其他组。在刺激12 h时,Bax/Bcl-2值最低。Western blot结果显示,与空白对照组相比,Cytochrome C表达水平也随着时间增加而增高,在12 h表达量最大,18 h表达量减少,阳性对照组该蛋白表达水平高于其他组,差异极显著(P<0.01)。随着刺激时间的增加,Caspase-3和Caspase-9蛋白被活化成cl-Caspase-3和cl-Caspase-9,均在12 h时变化最为显著(P<0.01),进一步验证了细胞凋亡的发生。与空白对照组相比细胞间连接蛋白ZO-1及VE-cadherin的转录水平和表达水平均呈时间依赖性减少,在12 h表达量最少(P<0.01)。综上所述,本研究首次证实Ts-p53可以通过引发细胞凋亡、破坏内皮细胞间连接蛋白两种方式破坏内皮细胞屏障,使血管内皮细胞通透性增加,该结果为旋毛虫感染发病机制的研究奠定了基础。

旋毛虫TRE重组蛋白免疫保护作用的研究

为进一步探讨旋毛虫海藻糖酶(Trehalase of Trichinella spiralis,TsTRE)蛋白对BALB/c小鼠的免疫保护作用,本研究将TsTRE蛋白进行Western-blot分析,并使用该蛋白对BALB/c小鼠进行3次免疫,然后分别感染50条和200条肌幼虫,从免疫前到攻虫试验结束,每周采集一次血清,且在攻虫后第7天和第42天分别计算成虫与肌幼虫减虫率。利用流式细胞术检测表达CD4+T淋巴细胞和表达CD8+T淋巴细胞比例及吞噬能力,利用CCK-8检测淋巴细胞增殖能力,利用ELISA抗体试剂盒检测血清中特异性抗体(IgG、IgG1和IgG2a)、Th1型细胞因子(IFN-γ、IL-2)及Th2型细胞因子(IL-4和IL-10)的水平。Western-blot结果显示,TsTRE蛋白可与小鼠感染旋毛虫的血清发生特异性结合;与PBS对照组相比,表达CD4+T细胞比例升高,而表达CD8+T细胞比例降低,差异均显著(P<0.05);脾淋巴细胞吞噬能力和增殖能力均加强,差异显著(P<0.05)。此外,ELISA方法检测结果显示,特异性抗体水平均极显著增长,且IgG1水平高于IgG2a水平;Th1/Th2型细胞因子水平均显增长趋势,且Th1型细胞因子水平在攻虫后第7天达到最高峰,Th2型细胞因子水平在攻虫后第14天达到最高峰。TsTRE(500)和TsTRE(2000)攻虫组的小鼠成虫与肌幼虫减虫率分别为46.32%、51.19%、40.49%和42.37%。以上结果表明,TsTRE蛋白可诱导小鼠细胞/体液免疫应答,该反应是前期以Th1为主导,后期以Th2为主导的Th1/Th2混合型免疫。以TsTRE为免疫原的疫苗具有一定的减虫作用,该蛋白有望成为疫苗研究新靶点,这为后续预防旋毛虫病提供基础数据。

低温胁迫对旋毛虫肌幼虫海藻糖及海藻糖酶的影响

为探究旋毛虫肌幼虫体内海藻糖酶(TsTRE)和海藻糖在抵抗低温胁迫中的作用,将旋毛虫肌幼虫置于37℃环境中培养1 h后,移至不同温度的环境中,通过qRT-PCR方法筛选出最佳胁迫温度,再在最佳胁迫温度下,应用qRT-PCR和Western-blot方法检测不同培养时间下TsTRE的基因转录水平与蛋白表达水平的变化,用3,5-二硝基水杨酸法检测TsTRE活性,用蒽酮比色法检测旋毛虫肌幼虫体内海藻糖含量的变化,免疫荧光检测TsTRE在虫体内的分布情况。结果显示,在最佳胁迫温度4℃下,可引起TsTRE基因转录水平、蛋白表达水平和酶活性显著下降,均在1 h时达到最低值,其分别下降约64.96%、68.89%和36.98%(P<0.01),随着低温胁迫时间的增加,TsTRE基因转录水平和蛋白表达水平整体呈“W”型趋势;而海藻糖含量则与之相反,呈“M”型趋势,在3 h达到最高值(P<0.01),约是对照组的1.6倍;TsTRE主要分布于旋毛虫肌幼虫全身表皮、中肠、后肠及生殖原基内,且低温处理组较对照组诱导的绿色荧光信号明显减弱(P<0.01)。以上研究揭示,在低温胁迫下,旋毛虫肌幼虫体内TsTRE表达的变化和海藻糖含量的变化呈此消彼长的关系,TsTRE表达水平及其酶活性的降低引起海藻糖迅速积累以保护虫体,本研究为进一步探讨旋毛虫抗低温的分子机制提供了理论参考。