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PTD-GFP融合蛋白的纯化及其转导效率测定 被引量:4
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作者 徐艳玲 岳玉环 +6 位作者 张国利 吴广谋 田园 张培培 付玉和 赵鑫 侯天全 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第1期25-28,257,共5页
为了纯化PTD-GFP融合蛋白,测定融合蛋白转导效率,研究融合蛋白在He La细胞中的转导效率与浓度的关系,试验诱导表达军事兽医研究所六室保存的含有p ET-20b-PTD-GFP重组质粒的BL21表达菌,超声破碎,取上清液通过多个层析介质得到高纯度融... 为了纯化PTD-GFP融合蛋白,测定融合蛋白转导效率,研究融合蛋白在He La细胞中的转导效率与浓度的关系,试验诱导表达军事兽医研究所六室保存的含有p ET-20b-PTD-GFP重组质粒的BL21表达菌,超声破碎,取上清液通过多个层析介质得到高纯度融合蛋白,将纯化的蛋白加入到体外培养的He La细胞中,在荧光显微镜下观察PTD-GFP的转导情况,用InfiniteF500多功能酶标仪检测荧光强度,分析融合蛋白浓度对转导效率的影响。结果表明:纯化的重组蛋白纯度达到90%。原浓度蛋白和1/2原蛋白浓度24 h后转导效率都达到100%。通过统计学软件得到转导效率与PTD-GFP融合蛋白浓度之间的线性关系,回归系数为0.151 456,相关系数为0.954。说明融合蛋白纯度较高,其转导效率对蛋白浓度具有依赖性,在一定浓度范围内随着浓度增加转导效率增加。 展开更多
关键词 蛋白转导域(PTD) 绿色荧光蛋白(GFP) 融合蛋白 纯化 转导效率
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犬α干扰素真核表达条件优化纯化及活性研究 被引量:2
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作者 付玉和 岳玉环 +7 位作者 李泽鸿 张国利 田园 谭成成 赵鑫 徐艳玲 张培培 侯天全 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第5期36-39,282,共5页
为了对高效表达犬α干扰素的毕赤酵母重组菌株进行表达条件的优化,对表达后的目的蛋白进行纯化及活性研究,研究通过单因素试验方法对影响犬α干扰素的真核表达摇瓶培养条件进行了优化,利用Phenyl Sphareose High Performance疏水层析介... 为了对高效表达犬α干扰素的毕赤酵母重组菌株进行表达条件的优化,对表达后的目的蛋白进行纯化及活性研究,研究通过单因素试验方法对影响犬α干扰素的真核表达摇瓶培养条件进行了优化,利用Phenyl Sphareose High Performance疏水层析介质,Q Sepharose High performance强阴离子交换层析介质对表达后目的蛋白进行纯化,期间采用Sephadex TM G-25 Fine介质脱盐,采用MDCK-VSV微量病变抑制法对纯化后蛋白的活性进行检测。结果表明:得出最佳的诱导表达条件为诱导温度28℃,诱导时间72 h,诱导p H值6.0,诱导甲醇浓度1.0%;优化后目的蛋白表达量达到0.18 mg/m L,比优化前提高了54%;纯化后获得纯度达90%以上的目的蛋白,测得目的蛋白的比活为1.08×108U/mg。说明摇瓶优化可显著提高目的蛋白的表达量,毕赤酵母重组菌株能够获得较高具有较高活性的目的蛋白,可用于犬α干扰素的大规模生产及临床应用。 展开更多
关键词 犬α干扰素 毕赤酵母 摇瓶优化 蛋白纯化 活性检测
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HSP65-PEAⅠ融合蛋白表达纯化及免疫效果研究 被引量:3
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作者 何苗 张国利 +6 位作者 陈萍 田园 岳玉环 吴广谋 于佳 史飞 侯天全 《中国实验诊断学》 2015年第5期700-704,共5页
目的通过基因工程手段在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白HSP65-PEAⅠ,建立小鼠实验模型,检测其抗体效价水平,初步评价免疫效果。方法扩增HSP65-PEAⅠ片段插入表达载体pET-28a中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,优化纯化条件,以HSP65-... 目的通过基因工程手段在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白HSP65-PEAⅠ,建立小鼠实验模型,检测其抗体效价水平,初步评价免疫效果。方法扩增HSP65-PEAⅠ片段插入表达载体pET-28a中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,优化纯化条件,以HSP65-PEAⅠ为免疫原对小鼠进行免疫接种。结果双酶切和测序鉴定结果证实HSP65-PEAⅠ成功克隆入pET-28a载体中,表达的重组蛋白相对分子量约为97 000,主要以包涵体形式表达,纯化后的重组蛋白纯度达90%,浓度为0.498mg/ml。免疫小鼠均在首免1周后采集的血清中检测到特异性抗体,抗体效价水平持续增长且在42天均达到了210。结论成功在E.coli中表达并经过纯化得到重组蛋白HSP65-PEAⅠ,确定了动物免疫程序,为制备抗烧烫伤多器官衰竭疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 热休克蛋白65 绿脓杆菌外毒素A 基因克隆 表达 纯化
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抗B型肉毒毒素治疗性胞内抗体的制备及活性研究
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作者 吉元刚 张国利 +12 位作者 李泽鸿 岳玉环 吴广谋 田园 刘雨玲 李玉洁 赵鑫 付玉和 王冬冬 张培培 侯天全 徐艳玲 马洪园 《中国兽药杂志》 北大核心 2016年第7期1-6,共6页
以克隆表达的B型肉毒毒素轻链蛋白(Bo NT/BL)为抗原,从噬菌体抗体库Tomlinson I+J筛选出得到活性高和特异性高的全人源单链抗体(Sc Fv),结合能够携带外源蛋白有效通过生物膜的小片段跨膜肽(TAT)制备跨膜单链抗体(TAT-Sc Fv)。经PCR后酶... 以克隆表达的B型肉毒毒素轻链蛋白(Bo NT/BL)为抗原,从噬菌体抗体库Tomlinson I+J筛选出得到活性高和特异性高的全人源单链抗体(Sc Fv),结合能够携带外源蛋白有效通过生物膜的小片段跨膜肽(TAT)制备跨膜单链抗体(TAT-Sc Fv)。经PCR后酶切,克隆到原核表达载体(p ET-28a-TAT)中,构建含有跨膜肽(TAT)的抗B型肉毒毒素胞内抗体融合蛋白,并在大肠杆菌中诱导表达,进行纯化工艺,对产物进行浓度纯度、亲和常数测定及生物活性研究。成功构建TAT-Sc Fv表达载体,融合蛋白相对分子量为32.7 k Da,主要以可溶形式表达,纯度也达到95%以上,胞内抗体中和B型肉毒毒素致病轻链得到TAT-Sc Fv的亲和常数为(1.133±0.273)×106L/mol,小鼠神经细胞乙酰胆碱定量测定实验证明胞内抗体具有较好的抗毒素活性。此结果为B型肉毒毒素治疗性胞内抗体的研制和肉毒中毒治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 跨膜肽(TAT) 重组蛋白 表达 蛋白纯化 亲和常数 乙酰胆碱
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A型肉毒毒素轻链蛋白的表达及纯化 被引量:1
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作者 徐艳玲 岳玉环 +6 位作者 张国利 吴广谋 田园 张培培 付玉和 赵鑫 侯天全 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2016年第5期469-472,共4页
目的构建A型肉毒毒素轻链表达载体重组质粒,在大肠埃希菌中表达后,利用金属螯合层析柱纯化。方法以p GEM-Bo NT/AL轻链质粒为模板,PCR扩增Bo NT/AL基因,克隆至表达载体p ET-28(a)中,构建重组质粒p ET-28(a)-Bo NT/AL,转化E.coli BL21(DE... 目的构建A型肉毒毒素轻链表达载体重组质粒,在大肠埃希菌中表达后,利用金属螯合层析柱纯化。方法以p GEM-Bo NT/AL轻链质粒为模板,PCR扩增Bo NT/AL基因,克隆至表达载体p ET-28(a)中,构建重组质粒p ET-28(a)-Bo NT/AL,转化E.coli BL21(DE3),分别于37、30、25℃IPTG诱导表达,表达产物经Chelating Sepharose 4Fast Flow(Cu^(2+))层析柱纯化,纯化产物经尿素梯度复性。结果质粒p ET-28(a)-Bo NT/AL经酶切鉴定及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约52 000,主要以包涵体形式存在,37℃诱导表达量最高,占菌体沉淀总蛋白的41%;包涵体经2%Trition-X100和2 mol/L尿素洗涤后,可去除部分杂蛋白,8 mol/L尿素能溶解大部分包涵体;经再次浓缩后,蛋白浓度可达89μg/ml,纯度达90%。结论成功克隆及表达了Bo NT/A轻链基因,为制备抗Bo NT/A轻链单链抗体以及研究肉毒中毒机制和治疗方案奠定了基础。 展开更多
关键词 A型肉毒毒素轻链 大肠埃希菌 基因表达 纯化
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A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65的原核表达及其纯化
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作者 王冬冬 张国利 +8 位作者 岳玉环 吴广谋 田园 吉元刚 徐艳玲 张培培 侯天全 赵鑫 付玉和 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2016年第12期1267-1270,共4页
目的原核表达A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65,并进行纯化。方法以CPA全基因为模板,PCR扩增rCPA基因,插入表达质粒p ET-28a(+)-HSP65,构建重组表达质粒p ET-28a-rCPA-HSP65,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物进行12%... 目的原核表达A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65,并进行纯化。方法以CPA全基因为模板,PCR扩增rCPA基因,插入表达质粒p ET-28a(+)-HSP65,构建重组表达质粒p ET-28a-rCPA-HSP65,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物进行12%SDS-PAGE分析;优化表达工艺进行高密度发酵,发酵产物经DEAE阴离子柱上复性后,再经金属螯合层析纯化。结果重组表达质粒p ET-28a-rCPA-HSP65经双酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的重组蛋白相对分子质量约90 000,主要以可溶性形式为主,表达量占菌体总蛋白的30.17%。利用TB培养基,IPTG 34℃诱导5 h的表达产物经纯化后,纯度约达95%,蛋白收率为4.5 mg/g湿菌。结论已成功表达并纯化了A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65,为后期疫苗生物学活性的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 A型产气荚膜梭菌α毒素 rCPA-HSP65 原核细胞 基因表达 高密度发酵 蛋白纯化
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重组金黄葡萄球菌肠毒素B及热休克蛋白65融合蛋白的原核表达及其在小鼠体内的体液免疫效果
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作者 侯天全 张国利 +6 位作者 滕利荣 岳玉环 吴广谋 田园 付玉禾 赵鑫 张培培 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第2期118-122,132,共6页
目的原核表达重组金黄葡萄球菌肠毒素B(recombinant Staphylococcus aureus enterotoxin B,r SEB)及热休克蛋白65(heat shock protein 65,HSP65)融合蛋白r SEB-HSP65,并探讨其在小鼠体内的体液免疫效果。方法采用分子生物学方法将修改过... 目的原核表达重组金黄葡萄球菌肠毒素B(recombinant Staphylococcus aureus enterotoxin B,r SEB)及热休克蛋白65(heat shock protein 65,HSP65)融合蛋白r SEB-HSP65,并探讨其在小鼠体内的体液免疫效果。方法采用分子生物学方法将修改过TCR Vβ结合区的r SEB基因与HSP65基因融合,构建重组表达质粒p ET-28a-r SEB-HSP65,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,经铜柱亲和层析纯化。将纯化蛋白经小鼠背部皮下注射,分别于第0、14、28天各免疫1次,分别于第14、28、42 d经小鼠尾静脉采血,分离血清,间接ELISA法检测小鼠血清中抗-SEB的Ig G水平。结果重组表达质粒p ET-28a-r SEB-HSP65经双酶切及PCR鉴定,证明构建正确。表达的重组蛋白r SEB-HSP65的相对分子质量约85 000,主要以包涵体形式表达,表达量约占全菌总蛋白的40.81%,纯化蛋白纯度约为90%。各组免疫小鼠均可产生较高滴度抗体,且在第14、28及42天大部分含铝佐剂疫苗组的效价显著高于相同剂量的无铝佐剂疫苗组(P<0.05),第42天时无铝佐剂低剂量疫苗组与含铝佐剂低剂疫苗量组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功在E.coli BL21(DE3)中表达了重组蛋白r SEB-HSP65,且可诱导小鼠产生较高的抗体水平。 展开更多
关键词 金黄葡萄球菌肠毒素B 热休克蛋白65 原核细胞 基因表达 体液免疫
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用于肉毒毒素活性测定的特异性绿色荧光融合蛋白的制备
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作者 吉元刚 张国利 +12 位作者 李泽鸿 岳玉环 吴广谋 田园 刘雨玲 李玉洁 赵鑫 付玉和 王冬冬 张培培 侯天全 徐艳玲 马洪园 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第9期901-905,共5页
目的制备含有7种血清型肉毒毒素切割位点(SNAP25-VAMP)的特异性绿色荧光融合蛋白,在E.coli中诱导表达,纯化后用于肉毒毒素活性测定。方法根据SNARE蛋白复合物中SNAPE25和VAMP基因序列及各血清型肉毒毒素(Bo NTs)的切割位点,设计合成含有... 目的制备含有7种血清型肉毒毒素切割位点(SNAP25-VAMP)的特异性绿色荧光融合蛋白,在E.coli中诱导表达,纯化后用于肉毒毒素活性测定。方法根据SNARE蛋白复合物中SNAPE25和VAMP基因序列及各血清型肉毒毒素(Bo NTs)的切割位点,设计合成含有SNAREs中突触小体(SNAP25)和突触小泡膜蛋白(VAMP)的Bam HⅠ-HIS6-SNAP62-Eco RⅠ-VAMP57C-TAA-HindⅢ(以下简称为SV)基因,连接至p ET-28a-GFP载体上,构建重组质粒p ET-28a-GFP-SV,转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达后,经DEAE阴离子交换层析、Cu2+金属螯合层析、Q阴离子交换层析3步纯化,BCA法测定纯化产物的蛋白浓度,ELISA法检测B型肉毒毒素轻链蛋白(Bo NT/BL)活性。结果构建的质粒p ET-28a-GFP-SV经双酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的GFP-SV融合蛋白相对分子量约40 000,主要以可溶形式存在,蛋白浓度为18.4μg/μl,纯度可达70%以上。利用该融合蛋白的荧光强弱变化可测定Bo NT/BL活性大小,同时也可测定其抗体中和活性大小。结论制备的含有SV的特异性绿色荧光融合蛋白在E.coli中获得了高效表达,为后续各型肉毒毒素活性检测及抗体中和毒素活性检测奠定了基础。 展开更多
关键词 SNAP25-VAMP 绿色荧光蛋白 肉毒毒素活性 血清型
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