甜菊自交胚挽救及其自交S_1代的主要性状分析

对甜菊(Stevia rebaudiana Bertoni)品种‘中山5号’(‘Zhongshan No. 5’)、‘中山6号’(‘Zhongshan No. 6’)、‘中山8号’(‘Zhongshan No. 8’)、‘江甜2号’(‘Jiangtian No. 2’)、‘谱星1号’(‘PC Star No. 1’)和‘守田3号’(‘Morita No. 3’)自交授粉后的有胚率进行了统计,进一步筛选出‘中山8号’的胚挽救方法,并对‘中山8号’自交S1代植株的主要性状进行了分析。结果表明:甜菊不同品种间的有胚率差异明显,其中,自交授粉后5 d‘中山8号’的有胚率最高(16. 0%),自交授粉后10 d以上6个品种的有胚率基本为0. 0%。随自交授粉后天数的增加,‘中山8号’胚珠和幼胚在MS培养基、愈伤诱导培养基(添加2. 0 mg·m L-16-BA和2. 0 mg·m L-1NAA的MS培养基)和分化诱导培养基(添加2. 0 mg·m L-16-BA和0. 2 mg·m L-1NAA的MS培养基)上的萌发时间逐渐缩短,萌发率逐渐升高。自交授粉后7～9 d‘中山8号’幼胚在MS培养基上的萌发率高达80%以上。短日照处理下,‘中山8号’自交S1代植株间现蕾期的差异较大,短日照处理10～46 d现蕾,其中,短日照处理15 d现蕾的植株最多,占植株总数的16. 5%。现蕾期‘中山8号’103个自交S1代植株叶片中莱鲍迪苷A(RA)、甜菊苷(ST)、莱鲍迪苷C(RC)、杜尔可苷A(DA)和总甜菊糖苷(TSG)的含量及RA、ST、RC和DA含量占TSG含量的比例的变化范围均较大,RA、ST、RC、DA和TSG的含量分别为0. 26%～11. 43%、0. 36%～6. 45%、1. 52%～9. 18%、0. 05%～1. 40%和5. 80%～16. 90%,RA、ST、RC和DA含量占TSG含量的比例分别为3. 19%～72. 06%、3. 20%～46. 98%、12. 59%～74. 27%和0. 53%～12. 33%。在‘中山8号’及其103个自交S1代植株中,‘中山8号’和9个自交S1代植株为高RA型,7个自交S1代植株为高RA-RC型,11个自交S1代植株为高RC型,1个自交S1代植株为高RA-RC-DA型。上述研究结果表明:胚挽救技术可克服甜菊自交不亲和受精后障碍,获得的自交S1代植株的现蕾期和甜菊糖苷含量变化范围较大,为甜菊的种质创制和新品种培育提供了有效途径。

甜菊叶片β-葡萄糖苷酶的提取及其性质研究

为研究β-葡萄糖苷酶在甜菊糖苷降解代谢中的作用,并为今后通过抑制甜菊糖苷的降解从而提高其含量的育种工作等奠定理论基础。本研究以甜菊为试验材料,首先对甜菊叶片β-葡萄糖苷酶的提取及酶活性测定方法进行了优化,并进一步对该酶性质进行了初步分析。结果表明,以pH 7.0的50 mmol/L磷酸缓冲液提取,研磨时添加等量PVP,粗酶液经20%~40%饱和度硫酸铵进行盐析的酶液其酶活性最高;以pNPG为底物测定其酶活性时37℃孵育60 min最佳。酶性质分析结果表明,该酶具有较高的热稳定性和pH值稳定性,其最适温度为30℃,最适pH 7.0;4℃保存时酶活性逐渐降低,至26天时酶活力仅余26.4%;在9种常见金属离子中Mn2+、Fe2+对该酶有显著的激活作用,而Cu^2+、Hg^2+对该酶的抑制作用较明显。

甜菊β-葡萄糖苷酶活性与甜菊糖苷含量变化的研究

为了研究甜菊β-葡萄糖苷酶在甜菊糖苷降解代谢中的作用,分别采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,简称HPLC)和分光光度计法对甜菊糖苷含量和β-葡萄糖苷酶活性进行同步检测分析。结果表明,不同甜菊品种中具有高甜菊苷(stevioside,简称St)含量的中山5号、大叶1号具有较高的β-葡萄糖苷酶活性;在中山5号开花期植株的不同器官中,β-葡萄糖苷酶活性与甜菊糖苷含量的变化趋势较一致,其中叶片中的β-葡萄糖苷酶活性、甜菊糖苷含量均最高,花中次之,茎中较低,根中均最低;中山5号3个主要生长时期叶片中的β-葡萄糖苷酶活性随生长发育的推进而逐渐升高,其甜菊糖苷含量则随生长发育的推进先升后降,现蕾期最高。研究结果可为后续甜菊β-葡萄糖苷酶及其基因的研究奠定基础。

甜菊耐寒相关基因SrDREB1As的克隆与转录因子特性分析

AP2/ERF转录因子家族中DREB亚族的A-1亚组基因对植物耐寒性具有显著的调控作用。本研究通过同源克隆的方法在甜菊中获得2个A-1亚组基因,分别命名为SrDREB1A1和SrDREB1A2(NCBI基因登录号分别为MK163640和MK163641)。SrDREB1A1 ORF全长660 bp,编码219个氨基酸残基,预测的蛋白分子量为24.58 kDa,等电点为5.42。SrDREB1A2 ORF全长630 bp,编码209个氨基酸残基,预测的蛋白分子量和等电点分别为23.21 kDa和5.41。进化树分析发现,SrDREB1A1和SrDREB1A2分别与紫茎泽兰的AaCBF及菊花的DgDREB1A亲缘关系最近,序列分析发现二者都具有一个典型的AP2结构域。进一步对蛋白功能研究发现,SrDREB1A1和SrDREB1A2都定位在细胞核并且具有转录激活活性。本研究将通过转基因手段为提高甜菊的耐寒性提供重要的基因资源。