基于网络药理学和分子对接探讨黄芪抗肝癌的作用机制研究

基于网络药理学及分子对接探讨黄芪抗肝癌的活性成分与分子作用机制。通过TCMSP数据库获取黄芪活性成分,Swiss Target Prediction预测成分靶点,采用Genecards数据库与OMIM数据库搜集肝癌靶点,Venny相映射黄芪抗肝癌的作用靶点,String数据库结合Cytoscape 3.7.2软件绘制肝癌靶点的蛋白相互作用网络(PPI)及“黄芪-成分-通路-肝癌”相互作用网络,DAVID数据库对核心靶点基因功能富集和通路富集分析。Surflex-Dock软件对黄芪关键成分与核心靶点进行分子对接验证。MTT法检测槲皮素、毛蕊异黄酮、山奈酚、芒柄花素、异鼠李素及华良姜素对肝癌细胞(HepG2)的影响。RT-qPCR法验证华良姜素对TP53、MAPK1、AKT1、IL6、MAPK8与VEGFA基因表达相对水平。本研究筛选出20个黄芪活性成分,涉及202个作用靶点及其100条KEGG信号通路,GO分析为487条生物功能。网络药理学分析黄芪可能是通过TP53、MAPK1、AKT1、IL6、MAPK8与VEGFA等关键靶点起到抗肝癌作用。分子对接表明靶点与成分有一定的结合性。MTT表明华良姜素对肝癌细胞(HepG2)的抑制作用较强于其他五个成分。RT-qPCR验证不同浓度的华良姜素对6个基因的表达量均为上调趋势,与KEGG通路分析所涉及基因一致。本研究初步探讨黄芪治疗肝癌具有多靶点、多通路的潜在作用机制,为后续验证黄芪抗肝癌的分子机制提供了依据。

基于网络药理学比较黄芪桂枝五物汤和四神煎治疗类风湿关节炎的作用机制

目的 探讨黄芪桂枝五物汤和四神煎治疗类风湿关节炎(RA)的可能作用机制。方法 首先采用网络药理学研究方法,收集RA疾病靶点和黄芪桂枝五物汤、四神煎中药成分靶点,并收集中药归经和证候信息。通过Cytoscape 3.9. 0软件构建“中药-成分-靶点-疾病”网络、中药-归经网络和中药-证候网络。基于STRING数据库构建蛋白质相互作用网络,进行KEGG通路富集分析。由“中药-成分-靶点-疾病”网络筛选关键化合物,蛋白相互作用网络筛选核心靶点,基于关键化合物和靶点进行分子对接。再进行细胞实验验证:采用10 ng/ml白细胞介素1β (IL-1β)诱导成纤维样滑膜细胞(FLS)建立细胞炎症模型后,用不同浓度的黄芪桂枝五物汤及其拆方、四神煎及其拆方分别干预24h后,通过MTT实验和ELISA法检测细胞存活率和白细胞介素6 (IL-6)水平。建立RAW264.7细胞炎症模型,经关键化合物分别干预24 h后,检测细胞上清中一氧化氮(NO)含量及细胞中P53基因表达。结果 药靶网络筛选得到黄芪桂枝五物汤和四神煎治疗RA的十种关键化合物包括槲皮素、山柰酚、异鼠李素、刺芒柄花素、没食子酸、儿茶素、花旗松素、木犀草素、黄芩素、汉黄芩素;据蛋白相互作用筛选得到核心靶点AKT1、PIK3CA、HRAS、NCOA1、TP53、STAT3、CCNA2;其中P53靶点与十种关键化合物亲和力较强。此外,富集分析结果表明,黄芪桂枝五物汤和四神煎通过调控PI3K-AKT、MAPK、JAK/STAT等多种信号通路发挥治疗作用。细胞实验表明,不同浓度黄芪桂枝五物汤、四神煎以及拆方均可抑制FLS细胞的炎性增殖和IL-6分泌(P<0.01)。除儿茶素外,其余关键化合物均可抑制RAW264.7细胞上清液NO分泌,且刺芒柄花素还可促进P53基因表达(P<0.01)。结论黄芪桂枝五物汤配伍由桂枝、白芍协同辅助黄芪,作用于AKT1、PIK3CA、TP53等核心靶点调控PI3KAKT、MAPK等信号通路发挥治疗RA的作用;四神煎以金银花、牛膝、石斛制约黄芪的温补之力,作用于AKT1、STAT3、TP53等核心靶点调控PI3K-AKT、JAK/STAT等信号通路发挥治疗RA的作用,而黄芪活性成分刺芒柄花素可能通过调节P53靶点治疗RA。

基于PI3K/Akt信号通路探讨华良姜素抗肝癌细胞HepG2凋亡的作用机制

目的:观察华良姜素的体外抗肝癌细胞HepG2凋亡的作用机制。方法:噻唑蓝(MTT)比色法检测华良姜素(0、5、10、25、50、100、150、300μmol·L^(-1))对HepG2细胞不同时间(24、48、72 h)的增殖抑制作用;异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡试剂盒检测华良姜素(0、3、15、75μmol·L^(-1))对HepG2细胞的凋亡作用;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测华良姜素对HepG2细胞中B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达的影响;转录组学分析华良姜素(15μmol·L^(-1))对HepG2细胞处理后基因差异表达与信号通路改变情况;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)验证差异基因[TEK、血小板源性生长因子α受体(PDGFRA)、脾酪氨酸激酶(SYK)、磷酸肌醇-3-激酶催化亚基G肽(PIK3CG)、Janus激酶3(JAK3)、膜相关鸟苷酸激酶转化蛋白2(MAGI2)]mRNA相对表达。结果:与空白组比较,华良姜素组HepG2细胞的增殖降低(P<0.05,P<0.01);凋亡率升高(P<0.01);Bax蛋白表达水平升高(P<0.05,P<0.01),Bcl-2的蛋白表达水平降低(P<0.01);转录测序得到59000个受调控的表达基因,受调控显著差异表达基因125个,其中表达上调差异基因47个,表达下调差异基因74个,京都基因和基因组数据库(KEGG)分析显示,加华良姜素后磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路中与凋亡相关的差异基因变化较大。与空白组比较,华良姜素组(15μmol·L^(-1))TEK、PDGFRA、SYK、PIK3CG、JAK3、MAGI2的mRNA表达水平降低(P<0.01)。结论:采用体外细胞学实验研究华良姜素能抑制HepG2细胞增殖,初步验证其凋亡,可能是影响了PI3K/Akt信号通路中部分差异基因的表达。为后续华良姜素抗肿瘤提供实验基础,同时有助于促进黄酮类化合物的开发利用及潜在的应用价值。