缺氧条件下1-磷酸鞘氨醇对人视网膜色素上皮细胞的促增生和抗凋亡作用

背景 1-磷酸鞘氨醇（S1P）是一种具有生物活性的脂质,是细胞内重要的信使分子,参与多种生物过程的调节,如细胞增生、迁移、分化、凋亡等.缺氧不仅是脉络膜新生血管（CNV）的关键始发因素,也是许多眼部疾病的病理基础,而视网膜色素上皮（RPE）细胞也参与缺氧后新生血管的形成,缺氧条件下S1P对人RPE细胞增生和凋亡的影响尚不清楚. 目的 观察缺氧条件下S1P对人RPE细胞增生和凋亡的影响,从而揭示S1P在CNV中的作用机制.方法 体外培养人RPE细胞株并进行传代,3～5代的RPE细胞分为6个组,空白对照组细胞进行常规培养,缺氧组细胞用200.00 μmol/L CoCl2培养细胞2h,不同浓度S1P干预组（0.01、0.10、1.00、10.00 μmol/L）用200.00 μmol/L CoCl2培养细胞2h后加入相应浓度的S1P,采用WST-1试剂盒检测各组细胞的吸光度（A）值;采用Hoechst染色检测各组细胞的凋亡情况,计算并比较各组细胞的凋亡率.结果 培养的细胞生长良好,可见细胞质内的色素颗粒.WST-1试剂盒检测显示,空白对照组细胞增生值（A值）为0.91 ±0.08,缺氧组为0.37±0.09,0.01、0.10、1.00和10.00 μmol/L S1P组分别为0.46±0.08、0.52±0.09、0.61 ±0.06和0.70±0.10,各组间的差异有统计学意义（F=21.104,P=0.000）,不同浓度S1P组A值均明显高于缺氧组,且随S1P浓度的升高而增加,差异均有统计学意义（均P＜0.05）;不同浓度的S1P组细胞存活率均明显高于缺氧组.Hoechst染色显示,空白对照组RPE形态正常,可见少数凋亡细胞;缺氧组可见大量凋亡细胞,细胞核呈淡蓝色,染色质浓缩;S1P干预后凋亡细胞数较缺氧组减少,随着S1P浓度的增加,凋亡细胞数逐渐减少.空白对照组凋亡率为（1.21±0.08）％,缺氧组为（8.99±0.09）％,0.01、0.10、1.00和10.00 μmol/L S1P组的细胞凋亡率分别为（6.60±0.08）％、（5.95±0.09）％、（4.81±0.06）％和（3.96±0.10）％,6个组间细胞凋亡率的总体差异有统计学意义（F=25.070,P=0.000）,与缺氧组比较,各S1P组细胞凋亡率均明显降低,差异均有统计学意义（均P＜0.05）,且随S1P的浓度升高其凋亡率逐渐降低.结论 缺氧条件下S1P对人RPE细胞的增生有促进作用,对细胞凋亡有抑制作用.

高糖条件下人视网膜色素上皮细胞的上皮-间质转化

背景 研究证实,有多种细胞参与增生性玻璃体视网膜病变（PVR）的发生和发展过程,其中RPE细胞的上皮-间质转化（EMT）可能与PVR有关,其主要生物学行为是RPE细胞的增生和迁移.已证实高血糖是糖尿病视网膜病变（DR）发病的主要原因,而高糖条件下RPE细胞是否发生EMT鲜有报道. 目的 建立体外高糖细胞培养模型,探讨高糖对人RPE的迁移能力及EMT的影响.方法 用含质量分数10％胎牛血清的DMEM/F12培养基对人RPE细胞D407细胞株进行体外培养和传代,取6～8代细胞用于实验.依据培养液中血糖浓度的不同将细胞分为3个组,正常对照组培养基中葡萄糖终浓度为5.5 mmol/L,高糖培养组葡萄糖终浓度为60.0 mmol/L,用含5.5 mmol/L葡萄糖和甘露醇的DMEM培养基培养细胞作为高渗对照组.采用细胞划痕试验法检测划痕后0、24、48和72 h时3个组RPE细胞的迁移率,用实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测高糖培养组在培养不同时间点RPE细胞间质化标志物闭锁小带蛋白-1（ZO-1）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA在细胞中的相对表达水平.结果 正常对照组培养的RPE细胞呈多角形,核仁清晰,排列致密;高糖培养组随着培养时间的延长,RPE细胞逐渐变大、变长,细胞结构不清,排列紊乱;高渗对照组细胞结构接近正常对照组.划痕试验显示,高糖培养组在划痕后48 h可见细胞迁移,划痕后72 h划痕基本消失,而正常对照组和高渗对照组划痕仍然存在.划痕后各时间点高糖培养组细胞迁移率明显高于正常对照组和高渗对照组,组间和各时间点的差异均有统计学意义（F分组=328.600,P=0.000;F时间=773.270,P=0.000）.RT-PCR结果显示,与正常对照组相比,高糖培养后48 h、72 h组细胞中ZO-1 mRNA的表达水平明显低于正常对照组,而α-SMA mRNA的表达水平明显高于正常对照组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）.结论 高糖条件下RPE细胞的迁移能力增强,发生EMT改变,可能参与增生性糖尿病视网膜病变（PDR）的发生.

不同方法治疗特发性黄斑裂孔对黄斑区解剖结构和脉络膜厚度的影响

目的:探讨玻璃体切割分别联合内界膜移植、内界膜翻瓣、自体血填充治疗特发性黄斑裂孔(IMH)的效果及对黄斑区解剖结构和脉络膜厚度的影响。方法:回顾性分析2017-01/2019-12我院收治的IMH患者79例82眼的临床资料,所有患者均行标准玻璃体切割+内界膜剥除术及气液交换术,其中联合内界膜移植28例29眼(内界膜移植组)、联合内界膜瓣翻转26例28眼(内界膜翻瓣组)、联合自体血填充25例25眼(自体血填充组)。观察三组患者裂孔闭合情况、裂孔闭合形态;记录最佳矫正视力(BCVA)、椭圆体带(EZ)及外界膜层(ELM)缺损直径、黄斑中心凹无血管区周长(PERIM)、浅层毛细血管层(SCP)血流密度及黄斑中心凹下(SFCT)、颞侧(TCT)、鼻侧(NCT)脉络膜厚度。结果:三组患者均成功完成手术,术后3mo时内界膜移植组、内界膜翻瓣组BCVA优于自体血填充组,EZ层缺损直径、ELM层缺损直径低于自体血填充组(P<0.05)。三组间黄斑裂孔闭合率、椭圆体区闭合率、PERIM、SCP血流密度、SFCT、TCT、NCT脉络膜厚度比较无差异(P>0.05);但三组患者黄斑裂孔闭合形态分型有差异(P<0.05),其中内界膜翻瓣组患者U型比例最高。结论:玻璃体切割联合手术中内界膜移植术、内界膜翻瓣术及自体血填充治疗IMH均可较好地恢复黄斑裂孔闭合,但内界膜移植术、内界膜翻瓣术在恢复黄斑区解剖结构、提高视力方面优于自体血填充。

慢性泪囊炎患者生活质量量表的制定及评价

目的制订慢性泪囊炎患者生活质量量表,评价量表的效度、信度以及反应度。方法根据WHO生活质量量表制定原则,提出慢性泪囊炎生活质量量表的理论构想,广泛查阅国内外多种普适性生活质量量表及视力相关专用生活质量量表,广泛听取议题小组成员和慢性泪囊炎患者的意见,采用结构化决策的方法,构建初始量表。以访谈式测量40例慢性泪囊炎患者的生活质量,采用频数分布、离散趋势法、相关系数法、因子分析法、区分度分析法等5种方法多维度筛选条目,最终形成慢性泪囊炎生活质量量表(DQOLS)。结果研制出生理、心理、社会3个维度共17个条目组成DQOLS,与理论构想相符。DQOLS 24 h重测信度为0.987,分半信度系数为0.882,Cronbachα系数为0.881。因子分析提取了5个公因子,累计方差贡献率73.029%,第一公因子为慢性泪囊炎对生理方面的影响,方差贡献率48.485%。各维度与总分相关系数介于0.712~0.896。DQOLS总分与SF-36总分、DLQI、EASI总分相关系数分别为0.776、0.764、0.672。患者鼻内窥镜下泪囊鼻腔吻合术治疗前后DQOLS总分差异有统计学意义,不同病程组患者的DQOLS总分差异均有统计学意义。结论 DQOLS可靠、有效、灵敏,准确反映了慢性泪囊炎患者生活质量的内涵,可作为慢性泪囊炎临床疗效评价的工具。

过氧化物酶体增生物激活受体γ及其激动剂在眼科疾病中的作用

过氧化物酶体增生物激活受体（PPARs）是配体依赖的核激素受体超家族成员转录因子，目前已有PPARν、PPARβ／δ和PPARν3种亚型，其中PPARν与纤维化疾病的关系日益引起人们的关注。PPARν由激动剂激活后通过控制炎症反应、抑制细胞的增生、诱导细胞的凋亡和分化、抑制血管形成及抗氧化等不同机制发挥抗纤维化作用，有望成为眼部纤维化疾病治疗的一个新途径。从PPARs及其分布、PPARν的结构与功能、PPARν配体及激动剂、PPARν的活化、PPARν在眼组织的表达、PPARν与眼部疾病几个方面就PPARν及其激动剂在眼部疾病中的作用进行综述。

577nm阈下微脉冲激光联合中药与薄式腹针治疗糖尿病黄斑水肿

目的 探讨577 nm阈下微脉冲激光+中药+腹针治疗糖尿病黄斑水肿(DME)的临床疗效。方法将90例DME患者90只眼随机分为对照组和观察组,每组45只眼。对照组患者行传统眼底激光光凝+口服羟苯磺酸钙治疗,观察组患者实施577 nm阈下微脉冲激光+中药+腹针治疗。观察治疗前后中医证候积分变化、BCVA、OCT检查黄斑部视网膜厚度及黄斑视网膜体积、FFA检查黄斑区荧光渗漏情况。结果 治疗6个月后,观察组BCVA为(0.57±0.13),明显高于对照组的(0.50±0.10);黄斑部视网膜厚度﹑黄斑视网膜体积分别为(242.20±104.00)μm﹑(8.90±1.36)mm3,均低于对照组的(290.85±105.60)μm、(10.56±1.88)mm3;AngⅡ、VEGF、ANGPT-3水平分别为(4.00±0.76)μg/L、(90.5±15.8)μg/L﹑(4.23±0.62)mg/L,均明显低于对照组的(5.58±0.98)μg/L﹑(135.0±24.3)μg/L﹑(5.45±0.89)mg/L;AngⅠ、ANGPT-4分别为(14.80±2.90)μg/L﹑(7.76±1.78)mg/L,均明显高于对照组的(10.54±2.02)μg/L﹑(6.20±1.12)mg/L;中医各项证候评分显著降低,且近期临床有效率为97.8%,高于对照组的75.6%;两组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 577 nm阈下微脉冲激光+中药+腹针治疗DME疗效确切,能有效改善黄斑水肿和视网膜渗漏,稳定视功能,安全性较高。

高糖对人视网膜色素上皮细胞神经钙黏连蛋白和纤维连接蛋白表达的影响

目的:体外建立高糖培养人视网膜色素上皮(hRPE)细胞模型,观察高糖条件下RPE细胞神经钙黏连蛋白(N-cadherin)和纤维连接蛋白(fibronectin)的表达变化,探讨高糖对RPE细胞发生上皮间质转化(EMT)的影响。方法:体外培养hRPE细胞,以60mmol/L的葡萄糖建立高糖模型,实验分对照组(5.5mmol/L的葡萄糖)和高糖24,48,72h组,用免疫组织化学法及Real-time PCR技术检测各组RPE细胞N-cadherin和fibronectin的表达。结果:高糖组RPE细胞出现排列紊乱,胞体变长变大,高糖72h组最明显。免疫组织化学法检测结果显示:与对照组相比,高糖组RPE细胞N-cadherin表达呈下降趋势;而fibronectin表达出现并呈升高趋势。Real-time PCR检测结果显示:与对照组相比,高糖组RPE细胞N-cadherin mRNA表达水平在24h时出现下降,72h时降低最明显(F=12.252,P=0.000),24h组与对照组相比差异无统计学意义,48h及72h组分别与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,高糖组RPE细胞fibronectin mRNA表达水平在24h时出现升高,72h时升高最明显(F=50.543,P=0.000),24h组与对照组相比差异无统计学意义,48h及72h组fibronectin mRNA表达水平明显升高,分别与对照组相比差异有统计学意义(P=0.000,P=0.000)。结论:高糖条件下RPE细胞上皮标记物N-cadherin表达下调,间质标记物fibronectin表达出现,发生EMT改变,这一现象为探讨增生性糖尿病视网膜病变的发病机制及其防治提供新的思路。

lncRNA KCNQ1OT1通过miR-19a-3p/TSHZ3影响高糖诱导的人视网膜上皮细胞增殖与凋亡

目的:观察长链非编码RNA(lncRNA)KCNQ1OT1通过miR-19a-3p/TSHZ3影响高糖(HG)诱导的人视网膜上皮细胞(ARPE-19)增殖、凋亡与氧化应激情况。方法:运用细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测5、15、45、135mmol/L HG刺激的ARPE-19的细胞存活率。将ARPE-19细胞分为NC组、45mmol/L HG组、si-NC+45mmol/L HG组、si-lncRNA KCNQ1OT1+45mmol/L HG组、miR-NC+45mmol/L HG组、miR-19a-3p mimics+45mmol/L HG组、si-con+45mmol/L HG组、si-TSHZ3+45mmol/LHG组、pcDNA+si-lncRNA KCNQ1OT1+45mmol/L HG组、pcDNA-TSHZ3+si-lncRNA KCNQ1OT1+45mmol/L HG组。运用CCK-8检测细胞存活率,qRT-PCR检测lncRNA KCNQ1OT1、miR-19a-3p和TSHZ3 mRNA表达,Western Blot检测TSHZ3、活化-含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)蛋白质的表达,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测氧化应激指标活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)水平。双荧光素酶活性检测lncRNA KCNQ1OT1和miR-19a-3p、miR-19a-3p和TSHZ3之间的靶向结合。结果:15、45、135mmol/L HG抑制ARPE-19细胞的存活率,后续选择细胞存活率约50%的HG浓度45mmol/L。45mmol/L HG提高ARPE-19细胞中lncRNA KCNQ1OT1、TSHZ3 mRNA、TSHZ3蛋白表达水平、凋亡率、Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达、ROS和MDA水平,降低miR-19a-3p表达水平、细胞存活率(P<0.05)。lncRNA KCNQ1OT1、TSHZ3低表达或miR-19a-3p高表达提高HG诱导的ARPE-19细胞的存活率,降低凋亡率、Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达、ROS和MDA水平(P<0.05)。lncRNA KCNQ1OT1靶向miR-19a-3p,miR-19a-3p靶向TSHZ3,lncRNA KCNQ1OT13通过miR-19a-3p调控TSHZ3的表达。lncRNA KCNQ1OT1低表达对HG诱导的ARPE-19细胞存活率、凋亡以及氧化应激的影响被TSHZ3过表达所逆转。结论:lncRNA KCNQ1OT13低表达通过miR-19a-3p/TSHZ3,促进HG诱导的ARPE-19,并抑制其凋亡和氧化应激。

鼠神经生长因子联合中药和眼三针保护闭角型青光眼视神经

目的 探讨鼠神经生长因子+益阴明目合剂+眼三针对原发性闭角型青光眼(PACG)视神经的保护疗效及对血清SOD、NO影响。方法 96例(96只眼)PACG患者随机分为对照组和观察组,各48例(48只眼)。对照组术后口服甲钴胺片治疗,观察组在对照组基础上联合鼠神经生长因子、益阴明目合剂、眼三针治疗。比较两组治疗前后视力、眼压、视野、P100波振幅及潜伏期、ET-1、NO、SOD、MDA水平。结果 观察组治疗后视力、MS、P100波振幅分别为(1.45±0.41)、(18.65±2.70)db、(7.99±2.18)μv,均高于对照组[分别为(0.98±0.42)、(14.60±2.40)db、(6.59±1.80)μv];观察组治疗后SOD活性高于对照组;观察组眼压、MD、P100潜伏期、MDA含量分别为(12.95±2.85)mmHg、(17.40±2.75)db、(98.20±13.40)ms、(2.40±0.65)nmol/(mg·prot),均低于对照组[分别为(20.20±5.86)mmHg、(19.98±3.20)db、(115.20±11.90)ms、(3.55±0.59)nmol/(mg·prot)],均P<0.05;治疗后观察组血浆ET-1为(54.20±6.00)ng/L,明显低于对照组的(63.15±7.25)ng/L;治疗后观察组血清sOD、NO水平分别为(285.40±32.00)IU/(mg·prot)、(35.45±4.45)ng/L,均高于对照组[分别为(240.20±24.50)IU/(mg·prot)、(31.99±4.23)ng/L];均P<0.05。结论 鼠神经生长因子+益阴明目合剂+眼三针多元化治疗方案对PACG术后视神经保护和修复具有独特优势,有效降低术后眼压,改善视盘和视网膜血液循环,清除自由基,增强抗氧化能力,抑制一氧化氮合酶,保护变性疾病中的光感受器。

睑板腺功能障碍性干眼症中西医多元化治疗临床观察

目的长期睑板腺病变诱发眼表炎性反应,使角膜和结膜发生改变,严重者视力下降,预后不良,临床常规治疗均无法彻底改善泪膜功能。本研究运用优化脉冲光(optimized pulse light,OPL)、中药熏蒸、雷火灸和ω-3不饱和脂肪酸等中西医综合治疗睑板腺功能障碍性(meibomain gland dysfunction,MGD)干眼症,旨在探讨其临床疗效及对泪液人趋化因子Fractalkine(fractalkine/CX3CL1)、白细胞介素1受体拮抗蛋白(cytokine 1receptor antagonist protein,IL-1Ra)水平的影响。方法选择2016-01-10-2016-12-31南阳医学高等专科学校第一附属医院收治的100例MGD性干眼症患者作为研究对象,根据入院先后顺序分为观察组和对照组,各50例。对照组采用常规西药治疗,观察组在对照组基础上,实施OPL+中药熏蒸+雷火灸+ω-3不饱和脂肪酸营养支持。观察治疗前后睑缘变化、睑板腺分泌物性状、睑板腺脂质排出程度、泪膜破裂时间、基础泪液分泌试验、角膜荧光素染色检查情况、中医半定量积分变化和临床疗效等。结果治疗后观察组左眼泪河高度为(0.52±0.13)mm,高于对照组的(0.24±0.16)mm,t=13.582,P<0.001;观察组右眼泪河高度为(0.50±0.16)mm,高于对照组的(0.25±0.17)mm,t=10.709,P<0.001;观察组分泌物形状评分为(0.71±0.14)分,低于对照组的(0.90±0.32)分,t=5.440,P<0.001;睑板腺挤压评分为(0.64±0.15)分,低于对照组的(0.88±0.22)分,t=9.013,P<0.001;观察组基础泪液分泌试验指标为(10.10±3.50)mm,高于对照组的(7.20±2.80)mm,t=6.470,P<0.001;观察组泪膜破裂时间为(10.56±2.42)s,高于对照组的(7.10±2.50)s,t=9.944,P<0.001;观察组角膜荧光素染色评分为(1.17±0.40)分,低于对照组的(2.52±0.60)分,t=18.721,P<0.001;观察组主观症状评分为(9.00±3.30)分,低于对照组的(12.21±4.22)分,t=5.992,P<0.001;治疗后观察组IL-1Ra水平为(5 421.65±1 214.28)pg/mL,低于对照组的(12 756.30±3 753.22)pg/mL,t=18.593,P<0.001;观察组fractalkine/CX3CL1水平为(197.60±85.30)pg/mL,低于对照组(456.40±102.60)pg/mL,t=19.396,P<0.001。治疗后观察组总有效率为92.0%,显著高于对照组的50.0%,χ2=42.836,P<0.001。结论中西医多元化治疗MGD干眼症体现中医标本兼治的优势,减少泪腺免疫攻击,降低眼表上皮损伤,从而有效缓解干眼症状,较好地保护眼表润滑与湿度,并发症少,复发率低。

改良深板层角膜移植术治疗大鼠严重基质坏死型单纯疱疹病毒性角膜基质炎的临床效果

目的探讨改良深板层角膜移植术(DLKP)治疗大鼠严重基质坏死型单纯疱疹病毒性角膜基质炎(HSK)的临床效果。方法通过单纯疱疹病毒1型KOS毒株接种于SD大鼠角膜上建立大鼠严重基质坏死型HSK模型,雌性Wistar大鼠作为供体,SD大鼠作为受体。采用同种异体角膜移植的方法在SD大鼠上实施DLKP术。采用随机方法将模型眼分为单纯模型组和改良DLKP手术组,术后7 d、21 d参照奥朗德(Holland)排斥反应评分标准对每组角膜植片移植的免疫排斥反应进行评估。分别于7 d、21 d随机处死每组大鼠3只行苏木素伊红(HE)染色观察角膜情况。结果裂隙灯显微镜显示严重基质坏死型HSK造模后7 d大鼠出现角膜基质炎改变,14 d角膜浑浊程度到达高峰,伴有大量新生血管生成。DLKP术后7 d裂隙灯显微镜下角膜水肿减轻,轻度混浊,术后21 d角膜透明无混浊水肿。角膜植片组织病理学染色显示模型组角膜基质层胶原纤维排列紊乱,大量炎症细胞及新生血管浸润;术后7 d角膜植片基质层胶原纤维排列轻度紊乱,少量炎症细胞浸润;术后21 d角膜植片质层胶原纤维排列较规则,几乎无炎症细胞浸润。大鼠术后7 d、14 d角膜植片排斥指数低于模型组(均为P<0.05)。结论应用改良DLKP术对大鼠严重基质坏死型HSK可达到治愈溃疡的目的。