红藻条斑紫菜凝集素的纯化及其色氨酸化学修饰对其活性的抑制作用

为了探索条斑紫菜凝集素(Porphyra yezoensis Ueda lectin,PYL)的作用机理,对其进行了分离和纯化.条斑紫菜经磷酸盐缓冲液浸泡、20%～75%硫酸铵分级、DEAE-纤维素52离子交换层析和Sephadex G-200凝胶过滤层析,得到PYL纯品.Sephadex G-200分子筛层析测得其分子量为63.2 kD,在非还原SDS-PAGE上显示1条蛋白染色带,分子量为63.1 kD,还原SDS-PAGE显示1条蛋白染色带,亚基分子量为15.8 kD.PYL在对兔、大鼠、鸡、羊、狗血细胞的凝集作用中,对大鼠红细胞的凝集活性最高.PYL在pH 6.50～10.53范围内均有活性,在pH 8.40～8.91活性最高.经42℃热处理10 min后,仍然对大鼠红细胞血凝活性保留12.5%,其活性最大温度范围为4℃～20℃,48℃加热10 min后,其活性完全丧失.EDTA对PYL的凝集活性有抑制作用,最小抑制浓度为1.56 mmol/L,而Ca2+和Mg2+未发生凝集抑制现象.PYL凝集大鼠红细胞的作用不被D-果糖、葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、菊粉、γ球蛋白、牛甲状腺球蛋白等所抑制,但可被蔗糖和麦芽糖抑制,最小抑制浓度蔗糖为20 mmol/L,麦芽糖为40 mmol/L.用N-溴代丁二酰亚胺(NBS)对PYL分子中的Trp残基进行化学修饰,有2.1个Trp残基被修饰,修饰后PYL活性丧失,表明Trp残基是PYL凝集活性所必需的基团.

条斑紫菜凝集素的化学修饰

为探索条斑紫菜凝集素(Porphyra yezoensis Ueda Lectin PYL)的作用机理,对纯化的条斑紫菜凝集素分子进行化学修饰,测定与其活性相关的氨基酸残基。结果表明,经碘乙酸、NEM、DTT修饰后的PYL,其凝集活性均未发生任何改变,表明分子中的自由巯基、二硫键与凝集活性无关。PYL经NEM修饰,有2.6个分子表面的自由-SH被修饰。在5mmol.L-1的NAI下,PYL凝集活性不变,但在10、20mmol.L-1 NAI时凝集活性分别丧失50%,75%,经羟胺处理后恢复部分活性,说明Tyr和氨基在PYL的凝集活性中起一定的作用;Glu和Asp的化学修饰,其凝集活性丧失93.75%,说明酸性氨基酸谷氨酸和天冬氨酸是PYL凝集活性的重要组成部分。