表皮生长因子对卵巢黄素化颗粒细胞cyclin D1和P21表达的影响

目的探讨表皮生长因子(EGF)对颗粒细胞细胞周期的影响及其在颗粒细胞增殖、分化机制中的作用。方法选取IVF-ET助孕方式治疗患者的卵巢黄素化颗粒细胞为研究对象,分离纯化后分为对照组和实验组,对照组为正常培养的颗粒细胞,不添加EGF;实验组为添加10 ng·mL^-1EGF培养24 h的颗粒细胞。利用CCK-8试剂盒在450 nm波长条件下用酶标仪检测细胞增殖状况以观察EGF作用的最佳浓度;利用流式细胞仪检测EGF对颗粒细胞周期的影响;利用RT PCR技术检测EGF对颗粒细胞cyclin D1和P21 mRNA相对表达的影响;利用Western blot技术检测EGF对颗粒细胞cyclin D1和P21相对蛋白表达水平的影响。结果采用本研究所建立的方法可以获得生长活力好、细胞纯度高以及较稳定的人卵巢黄素化颗粒细胞;CCK-8结果显示EGF最佳作用浓度为10 ng·mL^-1;细胞周期结果显示,EGF使人卵巢黄素化颗粒细胞周期表现为G0/G1期的比例减少,S+G2/M期的比例增高(P均<0.05);RT PCR结果显示,与对照组相比EGF作用后cyclin D1基因相对表达量升高,P21基因相对表达量下降(P均<0.01);Western blot结果显示,与对照组相比EGF作用后,颗粒细胞cyclin D1蛋白相对表达量升高,P21蛋白相对表达量降低(P均<0.05)。结论添加10 ng·mL^-1浓度的EGF培养人卵巢颗粒细胞可通过对细胞周期调控因子cyclin D1和P21mRNA及蛋白表达水平的影响,促进颗粒细胞增殖。

激活素A调节人卵巢颗粒细胞Smad2和CYP19A表达的研究

目的 探讨激活素A通过Smad2和CYP19A表达促进颗粒细胞增殖的作用途径。方法2017年3~8月,在宁夏医科大学总医院生殖医学中心就诊的患者中,选取体外受精-胚胎移植(IVFET)或卵胞质内单精子注射(ICSI)两种助孕方式治疗的15例患者为研究对象。取分离纯化的卵巢颗粒细胞,经原代培养48h后分组:激活素A组添加50μg/ml的激活素A,Bimagrumab组添加5μM选择性ActRⅡ抑制剂Bimagrumab,混合组同时添加50μg/ml的激活素A与20μM的Bimagrumab,再继续培养24h。采用Western印迹法检测蛋白表达水平,逆转录及实时PCR检测mRNA表达水平,细胞免疫荧光化学检测蛋白定位。采用单因素方差分析、t检验进行统计学分析。结果 激活素A组中ActRⅡ、p-Smad2/Smad2蛋白表达水平均高于空白对照组,Bimagrumab组中ActRⅡ和p-Smad2/Smad2蛋白表达水平低于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05),提示Bimagrumab对ActRⅡ有抑制效果,激活素A对ActRⅡ有促进效果。混合组中CYP19A1蛋白表达低于空白对照组,激活素A组中CYP19A1蛋白表达水平高于空白对照组;差异有统计学意义(P<0.05)。激活素A组中Smad2和CYP19A1mRNA表达水平高于空白对照组,混合组中Smad2和CYP19A1mRNA表达水平低于空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。细胞免疫化学染色显示,Smad2和CYP19A1存在于卵巢颗粒细胞中,Smad2阳性染色定位于细胞胞浆,CYP19A1阳性染色定位于细胞胞浆和细胞膜。结论 颗粒细胞分泌因子激活素A激活ActRⅡ信号通路,增加p-Smad2/Smad2和CYP19A1的表达水平,进一步促进颗粒细胞增殖和分化。

人胎盘间充质干细胞移植对化疗所致卵巢早衰大鼠卵巢功能的影响

目的研究人胎盘间充质干细胞(h PMSC)移植对环磷酰胺诱导的卵巢早衰(POF)模型大鼠卵巢功能修复过程中沉默信息调节因子1(SIRT1)、过氧化物酶体增殖物活化受体γ共激活因子1-α(PGC1-α)以及核转录因子E2相关因子2(Nrf2)活性的影响。方法将60只雌性SD大鼠随机分为空白对照组、POF模型组、h PMSC治疗组、治疗对照组,每组15只。通过大鼠腹腔注射环磷酰胺建立POF模型,治疗组于造模成功后给予h PMSC治疗。采用ELISA法测定血清中雌二醇(E2)、促卵泡生成素(FSH)、抗苗勒管激素(AMH)水平; HE染色法和Van Gie-son染色观察卵巢组织形态学和纤维化变化,Western blotting和免疫组织化学法检测卵巢组织SIRT1、PGC1-α、Nrf2的表达水平。结果 ELISA结果显示,POF模型组血清FSH水平明显高于空白对照组(P <0. 05),而E2、AMH水平则明显低于空白对照组,差异有统计学意义(P <0. 01);与POF模型组和治疗对照组相比,h PMSC移植治疗后FSH水平下降,AMH水平升高,差异有统计学意义(P <0. 01)。HE染色结果显示,POF模型组卵巢组织结构紊乱,原始卵泡和初级卵泡减少,闭锁卵泡增加,h PMSC治疗组中正常形态卵泡数目增多,闭锁卵泡数目减少。免疫组织化学结果显示,POF模型组SIRT1、PGC1-α、Nrf2蛋白表达相对于空白对照组降低,h PMSC治疗组蛋白表达相对于POF模型组升高。Western blotting结果显示,与空白对照组相比,POF模型组SIRT1、PGC1-α、Nrf2蛋白表达显著降低(P <0. 01);与POF模型组相比,h PMSC治疗组SIRT1、PGC1-α、Nrf2蛋白表达显著升高(P <0. 01)。结论 h PMSC移植对POF模型大鼠有抗氧化与修复卵巢功能的作用,其机制可能与激活SIRT1/PGC1-α/Nrf2信号通路有关。

人胎盘间充质干细胞移植通过降低超氧化物歧化酶1和解耦联蛋白-2的表达提高卵巢功能

目的探讨人胎盘间充质干细胞(h PMSC)移植治疗对环磷酰胺所致卵巢早衰(POF)模型SD大鼠超氧化物歧化酶1(SOD1)和解耦联蛋白-2(UCP-2)表达的影响。方法将60只雌性SD大鼠随机分为4组(n=15):空白对照组,POF模型组,治疗对照组,h PMSC移植组。以首计量50 mg/kg、维持剂量8 mg/kg连续14 d给大鼠腹腔注射环磷酰胺溶液建立POF模型,观察大鼠动情周期变化,采用ELISA方法测定血清中雌二醇(E2)、促卵泡生成素(FSH)、抗苗勒氏管激素(AMH)、活性氧族(ROS)、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHd G)水平;HE染色方法检测卵巢组织形态学及卵泡计数,VG染色法观察卵巢组织纤维化情况;采用免疫组织化学和Western blotting法测定SOD1和UCP-2蛋白表达。结果 ELISA结果显示:模型组血清FSH水平[(10.60±1.0)IU/L]明显高于空白对照组[(5.83±0.92)IU/L](P<0.01),而E2、AMH水平[(35.52±10.27)ng/L、(2 090.6±397.5)ng/L]则明显低于空白对照组[(65.62±3.76)ng/L、(3 636.39±204.46)ng/L],差异有统计学意义(P<0.01)。与空白对照组相比h PMSC移植组血清中ROS和8-OHd G升高(P<0.05)。卵泡计数显示h MSC移植组闭锁卵泡数(5.36±1.11)显著低于治疗对照组(8.01±2.22)和POF模型组(11.21±1.69)(P<0.05)。与治疗对照组相比,h PMSC移植组中ROS和8-OHdG显著下降(P<0.05)。VG染色显示,与治疗对照组比,hP MSC移植组纤维化面积比例显著降低(P<0.05)。Western blotting结果显示,与治疗对照组相比,hP MSC移植组中SOD1和UCP-2蛋白表达量显著下降(P<0.05),而hP MSC移植组与对照组则差异无统计学意义(P>0.05);免疫组织化学结果显示模型组中SOD1和UCP-2蛋白表达相较于治疗对照组是降低的,而hP MSC移植组相较于空白对照组则差异无统计学意义。结论 hP MSC移植改善POF模型SD大鼠氧化应激,降低SOD1及UCP-2表达,起到保护卵巢线粒体功能的作用。