不同核酸检测系统检测新冠病毒核酸室间质评物对比分析

目的对比分析不同核酸检测系统对新型冠状病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)核酸的检测能力差异,为选择2019-nCoV核酸提取、检测试剂及仪器提供参考。方法用本实验室在用的两种不同厂家的核酸提取仪器(配套试剂)、检测试剂及全自动荧光定量PCR仪交叉组合成8个检测系统,分别检测10份2019-nCoV室间质评样本,其中5份来自国家卫健委临床检验中心,5来自广东省临床检验中心。结果8个不同的检测系统检测10份室间质评样本,其中阳性8份,阴性2份,所有检测结果与预期结果完全一致。A提取试剂对应的检测系统测出的8份阳性样本的ORF1ab基因和N基因Ct值分别为30.67±4.96和30.67±6.06,B提取试剂对应的两个Ct值分别为29.96±5.00和29.26±5.45;E扩增仪器对应的两个Ct值分别为30.78±4.98和30.50±5.50,F扩增仪器对应的两个Ct值分别为29.85±4.97和29.43±6.07;以上两两对比差异无统计学意义。C检测试剂对应的两个Ct值分别为34.84±1.89和35.27±2.56,D检测试剂为25.80±2.05和24.84±2.20,两者对比差异有统计学意义;由于检测试剂D为快速法,如果加上其扩增程序中未采集荧光的10个循环,对应的Ct值分别为35.80±2.05和34.84±2.20,则和C检测试剂对比差异无统计学意义。结论8个不同检测系统分别检测10份室间质评样本结果与预期结果一致,说明本实验室日常组合的检测系统准确性是可靠的。每个实验室对于自行搭建的检测系统都应进行比对分析各组合性能。经比对本实验室使用的快速检测试剂与普通试剂的性能基本一致。如有条件,在做好生物安全风险评估和控制基础上,可使用阳性样本代替室间质评样本,并扩大样本数量,进一步对仪器及试剂的各项性能指标进行评价,同时加强人员的培训和比对,持续改进操作技术和流程。

广东地区流感H3N2毒株血凝素基因特征、进化和变异分析

为揭示广东地区2007～2010年甲型H3N2毒株血凝素(HA)基因特征和变异,采用时空抽样方法抽样,检测广东2007～2010年甲型H3N2毒株HA基因核苷酸序列,同时检索全球HA基因序列作为对照,采用Lasergene7.1和Mega 5.05软件对HA基因核苷酸序列进行比对和分析;并结合流行病学资料,对变异毒株进行进化速度分析;同时进行抗原分析。结果发现,广东2007～2010年H3N2毒株HA基因同义进化(Ks)和错义进化(Ka)速度分别为2.06×10-3～2.23×10-3核苷酸/年和1.05×10-3～1.21×10-3核苷酸/年,HA1较HA2的错义突变速率要高3.13倍。与疫苗株A/Perth/16/2009的HA基因比较,2009年广东毒株同源性达到98.8%～99.7%、2010年同源性达到98.0%～98.4%。在广东2007～2010年毒株中,HA1五个抗原表位均有氨基酸位点变异,尤其是2010年毒株B区(N160K)和D区(K174R/N)的变异;此外,广东2010年毒株受体结合部位(RBS)还发生K189E/N/Q和T228A置换变异;两个糖基化位点变异影响到抗原性;目前使用的H3N2疫苗株与目前流行毒株的抗原性有差异。广东地区2007～2010年的毒株中,血凝抑制抗体的抗原分析结果有差异。结果提示,目前广东乃至全球甲型H3N2毒株HA1B区和D区均有氨基酸位点变异,RBS的两个位点发生置换,糖基化位点变异影响到表位A区和B区抗原性;与WHO推荐2011年流感H3N2毒株疫苗株比较,目前流行毒株HA基因有抗原位点变异。

2009-2011年广东省甲型H1N1流感病毒血凝素基因的进化特征

目的了解2009--2011年广东甲型H1N1流感病毒血凝素基因的HA1进化特征。方法选取广东甲型H1N1流感病毒83株，提取病毒RNA，经RT—PCR反应扩增HA1并测序，测定的序列用生物信息软件分析，与GenBank中相关序列比较，并对推导的编码氨基酸序列进行进化分析。结果2009--2011年广东甲型H1N1流感病毒HAl基因的进化速率是5．2×10^-3，高于人季节性H1N1病毒；变异氨基酸多数位于HA蛋白表面，其中部分位于抗原决定簇；在两例死亡病例分离株HA1的第222位氨基酸发生D222G／D222N变异。结论遗传进化分析表明，甲型H1N1流感病毒发生了一定程度的变异，造成2011年初在广东的再次流行。HA1的第222位氨基酸变异可能与疾病的严重程度有关。

广东流感H3N2亚型神经氨酸酶基因变异和耐药分析

目的揭示广东地区2007～2010年甲型H3N2毒株神经氨酸酶(NA)基因特征、变异及对奥司他韦和扎那米韦的药物敏感性。方法采用时空抽样方法选取毒株,检测广东2007～2010年甲型H3N2毒株NA基因核苷酸序列,同时检索全球NA基因序列作为参照,采用Mega5.05和BioEdit7.0.1软件对NA基因核苷酸序列进行比对和分析;分析毒株变异进化速度;采用NA酶活性阻断试验检测病毒的奥司他韦和扎那米韦药物敏感性。结果广东2007～2010年H3N2毒株NA基因同义进化(Ks)和错义进化(Ka)速度分别为1.69×10-3～1.84×10-3核苷酸/年和1.07×10-3～1.15×10-3核苷酸/年,Ks值约为Ka值的1.5倍,揭示NA基因受自然选择压力较大。疫苗株A/Perth/10/2009与2010年和2011年广东毒株NA基因同源性分别为97.7%～98.2%、97.6%～97.7%。广东毒株NA基因有6个抗原表位变异,尤其是367位和369位氨基酸的变异频率较高。毒株A/Guangdong/548/2008发生耐药相关位点D151V,出现对奥司他韦敏感性降低;其余分离毒株均对奥司他韦和扎那米韦敏感;各年份毒株药物敏感性差异没有统计学意义。结论广东2007～2010年甲型H3N2毒株NA基因的6个抗原表位有变异,抗原变异的积累可能出现流感暴发;D151V变异可能降低H3N2病毒对奥司他韦敏感性,但广东大多数H3N2毒株对奥司他韦和扎那米韦仍敏感。