分型鉴别HPIV1、HPIV2及HPIV3多重荧光定量RT-PCR方法的建立及验证

目的建立可同时鉴别人副流感病毒1型(human parainfluenza virus type 1,HPIV1)、2型(HPIV2)、3型(HPIV3)的多重荧光定量RT-PCR方法,并进行验证。方法通过数据库下载HPIV1、HPIV2和HPIV3全基因组序列进行比对分析,选择保守区域,针对这3种病毒分别设计特异性引物及探针,以人核糖核酸酶P(RNase P)为内质控,建立多重荧光定量RT-PCR检测方法,并对方法的灵敏度、特异性和精密度进行验证。采用建立的方法对192份临床样本进行检测。结果经优化后,确定多重荧光定量RT-PCR反应体系为30μL,其中10×NeoscriptRTase/UNG Multi mix 3μL,5×Neoscript RT Premix Multi Buffer 6μL,HPIV1、HPIV2、HPIV3(100μmol/L)上下游引物各0.1μL,HPIV1、HPIV2、HPIV3探针(100μmol/L)各0.05μL,RNase P上下游引物(50μmol/L)各0.06μL,RNase P探针(50μmol/L)各0.03μL,模板15μL,ddH2O补至30μL。反应条件:50℃20 min,95℃3 min;95℃15 s,54℃30 s,共45个循环,每个循环退火时收集荧光信号。建立的多重荧光定量RT-PCR方法对HPIV1、HPIV2和HPIV3的最低检测限均达到500 copies/mL;与甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒无交叉反应;3种不同浓度的重组质粒标准品混合物组内和组间变异系数(CV)均小于3%。192份临床样本中,HPIV1、HPIV2和HPIV3均检测出,阳性率分别为7.81%、0.05%和3.1%。结论本研究建立的HPIV1、HPIV2和HPIV3多重荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的灵敏度、特异性和精密度,在HPIV的快速诊断和鉴别领域具有较高的临床应用前景。

鉴别检测野生株和基因缺失株非洲猪瘟病毒多重荧光定量PCR方法的建立

为建立一种鉴别检测野生型和基因缺失株非洲猪瘟病毒(ASFV)的方法,本研究根据GenBank中登录的ASFV P72、CD2v、MGF360-14L基因保守序列设计引物和探针,通过方阵法优化体系后,建立了一种可以同时检测P72、CD2v、MGF360-14L基因的多重荧光定量PCR方法。该方法与伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均无交叉反应,可鉴别野生型和基因缺失株ASFV,特异性强;敏感性试验结果显示,该方法对P72、CD2v和MGF360-14L重组质粒标准品的最低检测限均为100 copies/m L,敏感性高;组内和组间变异系数均小于2%,表明该方法重复性较好。利用ASFV核酸检测试剂盒与本实验室建立的方法分别对35份临床样品进行检测,两种方法的检出率均为68.57%,阳性符合率为100%。上述结果表明,本研究建立的多重荧光定量PCR方法对ASFV的鉴别检测、病原流行病学调查等研究具有重要意义。

牛呼吸道合胞体病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究旨在建立牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)实时荧光定量PCR(RT-qPCR)快速检测方法。通过查阅中外相关文献,设计并筛选出一对引物用于特异性扩增BRSV核衣壳(N)蛋白基因片段。对该目的基因进行克隆和测序后通过体外转录技术制备cRNA,计算体系中RNA的浓度;分装后验证其重复性与稳定性,并借助数字PCR进行联合定值确定参考品的最终浓度;使用该BRSV参考品作为模板,设计引物和探针,通过反应条件的优化,建立了BRSV RT-qPCR快速检测方法,并对其灵敏度、特异性、稳定性和准确性进行评价。结果表明,制备的BRSV参考品定值结果为(1.11±0.04)×1011拷贝数/mL。所建立的RT-qPCR快速检测方法能有效鉴定BRSV核酸参考品,最低可检出病毒核酸104拷贝数/mL;与另外8种反刍动物病原均无非特异性扩增,特异性强;对临床样本检测的结果与测序结果一致性达100%。结果显示,本研究建立的BRSV RT-qPCR快速检测方法特异性强、灵敏度高,具有较大的临床应用价值。