苹果赤霉素氧化酶基因MdGA2ox8的克隆及功能分析

【目的】从‘苏帅’苹果(Malus domestica)中分离克隆赤霉素氧化酶基因MdGA2ox8的开放阅读框(ORF),分析其序列特征及在苹果中的组织表达特异性,通过在烟草中过表达MdGA2ox8研究其对烟草生长发育的影响,为该基因功能分析及应用提供理论参考。【方法】采用RT-PCR方法从苹果中克隆出MdGA2ox8的ORF区。利用NCBI、DNAMAN和Pfam在线软件进行氨基酸序列比对和保守结构域分析;利用Expasy在线软件对MdGA2ox8氨基酸组成、分子量、等电点进行分析;利用SignalP和TMHMM Server V.2.0分别在线分析蛋白质的信号肽和预测蛋白质的跨膜结构域;利用MEGA 7.0软件构建系统进化树。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测MdGA2ox8在苹果不同组织中的表达量。构建MdGA2ox8过表达载体,采用农杆菌介导的遗传转化技术将MdGA2ox8导入烟草中,获得具有潮霉素抗性的转基因烟草植株,通过GUS染色、基因组PCR和RT-PCR鉴定转基因阳性植株;将野生型和转基因烟草移栽后,在第一朵花开放时测定转基因烟草的株高、节间长度和叶片长宽比以及烟草叶片叶绿素含量,激素GA1和GA4含量,并通过RT-qPCR方法分析烟草中相关基因的表达水平。【结果】成功克隆并获得了长为1 122 bp的MdGA2ox8 ORF区,编码373个氨基酸残基,蛋白相对分子质量为42.8 kD,理论等电点为5.44,不稳定系数为49.73,具有GA2ox的保守结构域DIOX_N和20G-Fell_Oxy,但无明显疏水区,无跨膜区,无信号肽,为非分泌蛋白。序列系统进化分析结果显示MdGA2ox8与白梨GA2ox8亲缘关系最近。RT-qPCR结果表明,MdGA2ox8在苹果各组织中差异表达,在花中的表达量最高,其次为老叶>幼叶>韧皮部,在木质部和幼果中几乎不表达。将MdGA2ox8转入模式植物烟草中,获得了5个转基因阳性株系。与野生型相比,过表达MdGA2ox8烟草植株GA4含量降低,GA1含量有所升高,其中野生型和转基因烟草GA1平均含量分别为1.26和1.75 ng·g-1,GA4平均含量分别为5.43和1.07 ng·g-1。与野生型相比,转基因烟草植株GA1和GA4总含量降低,使植株节间缩短、矮化以及花期推迟,其中野生型和转基因烟草植株平均高度分别为38.50和7.36 cm,节间长度分别为9.5和3.3 cm;转基因烟草叶片颜色深绿,叶片长宽比降低。烟草内源赤霉素合成途径相关基因NtGA3ox1和NtGA3ox2的表达水平受MdGA2ox8的正反馈调节。【结论】获得苹果赤霉素氧化酶基因MdGA2ox8的开放阅读框,MdGA2ox8具有组织表达差异性。MdGA2ox8过表达烟草植株中GA1和GA4总含量降低,导致植株节间长度缩短、植株矮化。

不同矮化中间砧对烟富3号苹果幼树叶片内源激素及糖含量的影响

【目的】研究不同矮化中间砧对烟富3号苹果幼树叶片内源激素及糖含量的影响,筛选出最适合静宁地区发展的烟富3号苹果砧穗组合。【方法】以烟富3号为接穗,以西府海棠为基砧,以M26、GM256、P16、P2、M27、T337、SH40、SH6和M9为中间砧,定植3 a(年)后调查树体生长指标,然后测定其叶片中ZT、GA3、IAA、ABA、蔗糖、果糖、葡萄糖、山梨糖醇的含量。【结果】P16作为烟富3号的矮化中间砧时,株高最小,ZT含量最高;P2作为烟富3号的矮化中间砧时,节间长最短,ABA含量最高,IAA/ABA和(ZT+IAA+GA3)/ABA的比值最小;以P16为烟富3号的矮化中间砧时,叶片中果糖与葡萄糖含量最高;以T337为烟富3号的矮化中间砧时,叶片中山梨糖醇与蔗糖含量最高。相关性分析发现株高、茎粗和节间长与ABA含量均呈负相关,节间长与IAA/ABA和(ZT+IAA+GA3)/ABA的比值呈正相关。【结论】P2和P16作为烟富3号的矮化中间砧时,树体生长量最小,叶片中的ABA含量显著高于其他砧穗组合,IAA/ABA和(ZT+IAA+GA3)/ABA的比值最小,说明P2和P16矮化性在9种矮化中间砧中最好。SH40和SH6的矮化性仅次于P2和P16,树体与P2和P16相比更为中庸,仅从树势与矮化性方面来看,更适合作为烟富3号的矮化中间砧。

‘南通小方柿’赤霉素不敏感基因DkGAI2的克隆与功能分析

【目的】对DkGAI2的亚细胞定位及表达特性进行分析,并将DkGAI2转化烟草,分析转基因烟草的生理和形态指标,为GAI的深入研究提供理论基础。【方法】以‘南通小方柿’高通量转录组测序结果中标注的GAI2为原始序列(未发表),利用RT-PCR,3′RACE和5′RACE技术从‘南通小方柿’中克隆得到DkGAI2的序列全长。利用生物信息学分析其序列特征,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析DkGAI2在‘大方柿’及‘南通小方柿’5个不同物候期的表达特性以及DkGAI2在‘南通小方柿’不同组织中的表达特性,构建瞬时表达载体pCAMBIA-GFP-1302-DkGAI2,并瞬时侵染烟草分析DkGAI2的亚细胞定位,通过构建DkGAI2植物双元表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草,经过GUS染色、RT-PCR对转基因烟草株系进行鉴定;并将野生型和转基因烟草移栽,于第一朵花开放时测定转基因植株的株高、节间长度、叶片长宽比以及GA1和GA4含量。【结果】从‘南通小方柿’中克隆得到了1827 bp的DkGAI2,DkGAI2核苷酸序列与猕猴桃(KF588651.1)、光皮烨(MF149049.1)、砂梨(KX078214.1)、苹果(FJ535245.1)、葡萄(MG738718.1)的相似度达72%-80%,DkGAI2具有DELLA蛋白家族特有的DELLA结构域,属于DELLA蛋白基因家族。DkGAI2编码608个氨基酸,相对分子质量为66.5 kD,理论等电点为5.54,不稳定系数为50.41,无明显疏水区,无跨膜区,无信号肽。序列系统进化分析结果显示,DkGAI2与葡萄亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示,DkGAI2在‘南通小方柿’5个不同物候期的表达量都高于‘大方柿’;DkGAI2在‘南通小方柿’不同组织中表现出组织表达特异性,其中,在老叶中表达量最高,其次为茎尖和幼叶,而在幼果中几乎不表达。pCAMBIA-GFP-1302-DkGAI2融合蛋白的绿色荧光信号位于细胞核中,表明DkGAI2编码蛋白位于细胞核。经过GUS染色和RT-PCR检测,共获得5个转DkGAI2烟草株系,转基因烟草叶片GA1含量增加,GA4含量降低,GA1和GA4总含量降低,且转基因烟草植株出现植株矮化、节间缩短、叶片长宽比降低及花期延迟的表型。【结论】DkGAI2具有组织表达特异性,定位于细胞核,DkGAI2在‘南通小方柿’5个不同物候期的表达量均高于‘大方柿’。推测DkGAI2可能通过降低GA4的含量进而引起植株矮化。

‘苏帅’苹果表观遗传变异分析

为探索杂交品种‘苏帅’表观优良性状遗传的生理机制,以杂交品种‘苏帅’和父本‘金冠’、母本‘印度’为材料,通过分析‘苏帅’和‘金冠’、‘印度’等苹果品种的节间数、节间长度以及叶片内源激素、果实可溶性固形物、可滴定酸、叶绿素的含量;采用石蜡切片法、扫描电镜等方法比较其叶片结构,测定叶片光合气体交换参数。结果表明,‘金冠’和‘印度’的节间长度显著大于‘苏帅’苹果的节间长度,‘苏帅’苹果叶片叶绿素相对含量显著高于‘金冠’和‘印度’;果实可溶性固形物含量与‘金冠’虽然没有显著性差异,但可滴定酸的含量明显高于‘金冠’苹果;‘苏帅’苹果内源激素脱落酸(ABA)、赤霉素(GA)、吲哚-3-乙酸(IAA)、玉米素核苷(ZR)与‘金冠’和‘印度’相比均呈显著差异。‘苏帅’苹果叶片下表皮气孔长度大于‘印度’,且差异极显著,但小于‘金冠’,气孔宽度显著宽于‘印度’,与‘金冠’没有明显差异;‘苏帅’苹果气孔密度极显著小于‘金冠’和‘印度’;‘金冠’和‘印度’栅栏细胞组织排列较紧密,栅栏组织和海绵组织分界限明显,而‘苏帅’苹果的栅栏组织细胞排列相对杂乱,细胞大小也不一致,与海绵组织界限不明显;‘苏帅’苹果叶片、上下表皮、栅栏组织及海绵组织厚度显著高于‘金冠’和‘印度’,栅栏组织和海绵组织比值也显著高于‘金冠’和‘印度’。‘苏帅’苹果与父母本相比表现出节间短、叶片变厚、光合作用增强等性状多样性,为苹果生产提供了新品种,也为苹果新品种的培育提供了珍贵的种质资源。

甜柿叶片矿质元素含量的年周期变化规律

以甜柿品种次郎、大秋、甘秋、禅寺丸为材料,连续采集甜柿生育期内土壤样品和叶片样品,进行营养元素含量测定,并对土壤和叶片营养元素含量进行相关分析。结果表明：随着生育期的变化,叶片氮和磷含量呈现下降趋势,钾和铁含量呈先上升后下降的趋势,钙和锰含量呈现上升趋势,磷含量上升后保持相对稳定,锌和铜含量呈现先下降后上升;大秋、甘秋、禅寺丸吸收钾分别集中在5-7月份、5-8月份、5-9月份;甜柿吸收磷主要集中在果实采收后;甜柿在生育期内对钙肥需求量较大;次郎、大秋吸收镁和锰主要集中在5-8月份;甘秋、禅寺丸吸收镁和锰主要集中在5-9月份;在8月之前,次郎、甘秋和禅寺丸叶片可能尚未成熟,树体需要吸收大量铁肥。

‘南通小方柿’cDNA文库构建及DkGA2ox2调控因子的筛选

本研究利用酵母单杂技术筛选DkGA2ox2基因上游转录因子,为进一步研究其表达调控机制提供理论基础。利用HiTAIL-PCR技术获得启动子序列,连入诱饵载体,转化进诱饵菌株。利用Gateway技术构建‘南通小方柿’cDNA文库,再共转化诱饵菌株,筛选得到转录因子。通过HiTAIL-PCR共获得1205 bp启动子序列。构建的文库库容为1.4×107,插入片段大小在750~2000 bp间,重组率100%。初步筛选出HB蛋白、FLL3蛋白和EIN3/EIL1蛋白3个候选蛋白,为探索DkGA2ox2基因上游调控机制提供了理论支撑。