PCV4 PCR检测方法的建立及河南地区PCV4的遗传进化分析

猪圆环病毒4型(PCV4)于2019年在我国湖南省患有猪呼吸道疾病、腹泻及皮炎肾病综合征的猪群中首次发现。为进一步了解该病毒在河南地区的流行和遗传演化情况,本研究根据GenBank中PCV4 Cap基因序列,设计了1对特异性引物,经反应条件优化,建立了检测PCV4的PCR方法。特异性试验结果显示,该方法仅对PCV4能扩增出约400 bp的目的条带,对PCV2、PCV3、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、大肠杆菌、沙门氏菌及阴性对照均无该目的条带;对PCV4质粒标准品的检测限为54.8拷贝/μL;对来自不同地区的3份PCV4肺组织样品DNA于不同时间分别重复扩增3次,结果一致且均为阳性。表明该PCR方法具有良好的特异性,敏感性和重复性。采用该方法对河南省部分地区16个猪场137份组织样品进行检测,结果显示,PCV4阳性率为13.87%(19/137),有7个地区为PCV4阳性,且猪场阳性率为43.75%(7/16),表明PCV4已在河南地区流行。对PCV4的部分Cap基因进行克隆、测序及遗传进化分析。结果显示,成功克隆2份PCV4阳性样品的部分Cap基因(命名为XX和LY),与GenBank中PCV4参考株(PCV4 HNU-AHZ-2019)相应基因的同源性分别为99.2%和98.4%。Cap基因的系统发育分析显示,XX和LY与PCV4 HNU-AHZ-2019株相应基因同属于一个独特的分支,而与其他圆环病毒属相应基因处于不同的分支,表明XX和LY与PCV4 HNU-AHZ-2019株相应基因亲缘关系较近。本研究为PCV4感染的早期监测和该病的防控提供了有力的技术支持。

表达高致病性和NADC30样PRRSV毒株GP5蛋白的重组伪狂犬病病毒的构建

参考猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)株HENAN-XINX基因组序列(GenBank登录号:KF611905)中GP5基因,合成1对特异性引物,BamHⅠ和HindⅢ分别引入到其5′端,RT-PCR扩增NADC30样PRRSV(NADC30-like PRRSV)毒株GP5基因。将扩增片段插入到真核表达质粒pBApo-EF1α_Pur_DNA的BamHⅠ和HindⅢ位点,然后扩增含GP5/NA的表达盒,将其导入含高致病性PRRSV(HP-PRRSV)GP5基因的伪狂犬病病毒(PRV)转移质粒pG-GP5/HP-EGFP中,构建重组质粒pG-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP。用脂质体转染法将PRV变异株3基因缺失株rPRV-gE-/gI-/TK-基因组与pG-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP质粒共转染ST细胞,得到携带有HP-PRRSV和NADC30-like PRRSV的GP5基因和绿色荧光蛋白标记基因的重组PRV株rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30-EGFP。该重组病毒与CRISPR/Cas9-EGFP敲除质粒共转染ST细胞,经4轮病毒空斑纯化得到了无绿色荧光标签的重组病毒rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30株。经PCR和RT-PCR证实成功构建重组病毒rPRV-GP5/HP-GP5/NADC30。

猪圆环病毒3型和4型双重PCR检测方法的建立

为了检测和鉴别猪圆环病毒3型(PCV3)和4型(PCV4),根据GenBank已登录的PCV3和PCV4基因序列,在PCV3 Rep和PCV4 Cap基因的高度保守区域设计并合成2对特异性引物,经过双重PCR反应条件优化,建立了能够同时检测PCV3/4的双重PCR方法。结果显示,该方法能同时扩增出138(PCV3)和391 bp(PCV4)特异片段,而对PCV2、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒核酸扩增结果均为阴性。PCV3/4的检测极限分别为74.5,90.2拷贝/μL。经临床样本检测结果表明,本试验建立了同时检测PCV3/4双重PCR方法,且具有准确、可靠、灵敏度高、特异性强的特点,为PCV3/4的临床检测和鉴别诊断提供了技术支持。

猪圆环病毒2型和4型双重PCR检测方法的建立

旨在建立一种能同时快速检测猪圆环病毒2型(PCV2)和4型(PCV4)的双重PCR方法。参考GenBank中PCV2和PCV4基因组序列,分别在PCV2 Rep和PCV4 Cap基因高度保守区设计2对特异性引物,经双重PCR条件优化,建立同时快速检测PCV2/4的双重PCR方法。该方法能同时扩增出264 bp(PCV2)和391 bp(PCV4) 2条特异性片段,而对其他8种常见猪病原扩增均为阴性;PCV2/4的最低检测量分别为61.1,54.9拷贝/μL。应用该方法对河南及山西省内60份临床样品进行检测,检测结果表明PCV2的检出率为51.67%(31/60),PCV4的检出率为18.33%(11/60),混合感染检出率为16.67%(10/57),单一PCR及双重PCR检测结果符合率100%。本研究建立的双重PCR检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好等优点,适合对PCV2和PCV4鉴别诊断和检测。

猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型和3型三重PCR检测方法的建立

为了建立能够同时检测猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)单一或混合感染的PCR检测方法,参考GenBank中PRV gE基因、PCV2和PCV3全基因序列,针对PRV gE、PCV2 Rep和PCV3 Rep基因的保守区域,利用Primer 5.0设计3对特异性引物,随后对其扩增条件进行优化,建立能够同时检测PRV、PCV2和PCV3的三重PCR方法。该方法能同时扩增PRV的429 bp、PCV2的273 bp和PCV3的344 bp特异性片段,而对常见的其他猪病原扩增均为阴性。PRV、PCV2和PCV3的最低检出量分别为1 250.0、693.0和91.2拷贝/μL。运用三重PCR和单项PCR检测疑似患有母猪繁殖障碍或呼吸系统疾病的74份临床病料,发现PRV、PCV2和PCV3的阳性率分别为29.73%(22/74)、71.62%(53/74)和58.11%(43/74),且三重PCR与单项PCR检测结果的符合率为100%。本试验建立了能够同时检测PRV、PCV2和PCV3的三重PCR检测方法,且该方法具有良好的特异性、灵敏性和准确性,为PRV、PCV2和PCV3的临床诊断和监测提供技术支持。

猪伪狂犬病病毒变异株gE/gI/TK三基因缺失株rPRV NY-gE^-/gI^-/TK^-的纯化及生物学特性

将猪伪狂犬病病毒(PRV)转移质粒pUC-TKLR与含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的gE/gI/TK三基因缺失PRV变异株rPRV NY^-gE^-/gI^-/TK^-/EGFP+基因组经脂质体转染至ST细胞中,进行无荧光重组病毒蚀斑筛选、纯化,并对该病毒在多种细胞上增殖特性、病毒滴度、一步生长曲线和遗传稳定性及其对小鼠的安全性等进行初步研究。结果显示,成功获得重组病毒rPRV NY^-gE^-/gI^-/TK^-,不含EGFP。经PCR及测序鉴定,证实获得的rPRV NY^-gE^-/gI^-/TK^-在TK基因上缺失311 bp。rPRV NY^-gE^-/gI^-/TK^-在ST、PK^-15、VERO和MDCK细胞上的TCID50分别为106.375/0.1 mL,105.625/0.1 mL,105.375/0.1 mL,103.875/0.1 mL;与亲本毒株NY在ST细胞中的毒力(106.5/0.1 mL)相近;当rPRV NY^-gE^-/gI^-/TK^-传至20代时,病变细胞仍无绿色荧光,缺失部分TK基因(311 bp),且对小鼠是安全的。