酿酒酵母高效自主复制区的筛选与鉴定

在酵母表达过程中,传统的表达载体存在着拷贝数低以及稳定性差的缺点。因此,找到一个可用于构建复制整合型载体的高效酵母自动复制区(Autonomously Replicating Sequence,ARS)是解决问题的关键。研究中,从酿酒酵母基因组中扩增得到4种不同的ARS(ARS304、ARS315、ARS735、ARS1512),然后连接到整合载体p NTS2K中,得到4种复制整合型载体(p NTS2K-ARS304、p NTS2K-ARS315、p NTS2K-ARS735、p NTS2KARS1512)。经电转化后,4种转化子(36a(p NTS2K-ARS304)、36a(p NTS2K-ARS315)、36a(p NTS2K-ARS735)、36a(p NTS2K-ARS1512))都能在含有300μg/m L G418的YPD平板上生长。然而,只有转化子36a(p NTS2KARS315)能在含有500μg/m L G418的YPD液体培养基里较快生长。经过G418耐受性检测后,36a(p NTS2KARS315)仍能在含有1 mg/m L G418的YPD培养基中很好地生长。此外,通过质粒p NTS2K-ARS315表达荧光蛋白,其表达效果高于普通商业质粒。实验结果证明,4种复制区都能在酿酒酵母中独立自主复制,其中ARS315复制能力最强。因此,ARS315可用于构建高拷贝且稳定的重组质粒,为构建高表达且稳定的工程酵母菌株奠定了基础。