青蛤(Cyclina sinensis)ERK基因的克隆及其在Poly I:C刺激下的表达分析

[目的]研究青蛤(Cyclina sinensis) ERK基因的克隆及在Poly I:C刺激下的表达情况。[方法]在已建立的青蛤转录组文库中筛选得到青蛤细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases)基因类似序列。运用生物信息学软件在线对该基因进行结构分析。采用PCR技术克隆基因,并使用实时荧光定量PCR技术克隆得到Cs ERK基因在青蛤5个不同组织中的表达情况及在干扰素诱导剂PolyI:C的刺激下ERK基因在青蛤血淋巴中的时序性表达情况。[结果]ERK基因序列全长为2 407 bp,开放阅读框长1 338 bp,共编码445个氨基酸。ERK基因在青蛤的血淋巴、外套膜、闭壳肌、肝脏和鳃5个组织中均表达,在血淋巴中表达量最高,闭壳肌中表达量最低。青蛤ERK基因在Poly I:C胁迫下表达量在6 h时达到最大值,与对照组相比差异极显著(P<0.01)。[结论]ERK基因所指导合成的蛋白是青蛤重要的免疫信号通路蛋白。

青蛤(Cyclina sinensis)IKK基因的克隆及其在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激下的表达分析

利用构建的青蛤(Cyclina sinensis)转录组文库,筛选到青蛤IKK基因的类似序列。经设计引物克隆比对后确认为CsIKK基因。利用生物信息学软件在线对该基因进行结构分析。采用PCR技术克隆基因,并使用实时荧光定量PCR技术克隆得到CsIKK基因在青蛤五个不同组织中的表达情况及在鳗弧菌(Vibrioanguillarum)的刺激下IKK基因在青蛤血淋巴中的时序性表达情况。综合结果得到, CsIKK基因序列开放阅读框长2298bp,编码765个氨基酸。IKK基因在青蛤的血淋巴、外套膜、闭壳肌、肝脏、性腺和鳃六个组织中均表达,在血淋巴中表达量最高。青蛤IKK基因在鳗弧菌胁迫下表达量在6h时达到最大值,与对照组相比差异极显著(P<0.01),表明该基因所指导的蛋白是青蛤重要的免疫信号通路蛋白。

青蛤(Cyclina sinensis)AP-1基因的克隆及在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)侵染下的表达分析

为了探究青蛤(Cyclina sinensis)转录因子(transcription factor gene,AP-1)在病原微生物侵染下的免疫防御应答过程中的潜在作用,本研究采用转录组测序筛选、设计特异性引物并成功克隆得到青蛤AP-1基因的c DNA序列(Gen Bank注册号:KX840340),利用生物信息学在线软件进行了生物信息学分析,结果显示:AP-1基因全长1914bp,结构域全长195bp,编码65个氨基酸,开放阅读框全长825bp,编码274个氨基酸,存在一个保守的b ZIP功能域;是重要的转录因子。运用实时荧光定量PCR(q PCR)的方法分析了Ap-1基因在青蛤5个组织中表达过程变化,结果表明:Ap-1基因在血淋巴、外套膜、肝脏、闭壳肌、腮等组织中广泛表达;在血淋巴中表达量最高,在闭壳肌中次之,然后为鳃和外套膜,在肝脏中表达量最低,约为血淋巴的1/7。另外,我们还分析了鳗弧菌(Vibrio anguillarum)侵染青蛤血淋巴后的变化情况,结果显示:在鳗弧菌侵染后,与对照组相比,青蛤血淋巴中的AP-1表达量明显升高,在24h时Ap-1基因表达量最大,与对照组差异极显著(P<0.01)。说明Ap-1基因在青蛤的免疫防御反应中具有重要作用,同时也为进一步研究AP-1在病原微生物侵染青蛤过程中的功能和作用机制奠定了基础。

青蛤丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)基因的克隆及其在鳗弧菌胁迫下的表达分析

采用Illumina MiSeq二代测序方法筛选得到青蛤丝裂原活化蛋白激酶(MAPK/p38)基因相似序列,进一步克隆得到全长cDNA.利用荧光定量PCR技术检测该基因在青蛤各组织中以及在鳗弧菌胁迫下的组织表达特征.结果显示,该基因全长共1781bp,开放阅读框长度为1104bp,编码367个氨基酸.在正常条件下该基因在青蛤体各组织中都表达,其中血淋巴中表达量最高,肝脏次之,鳃中最少.经菌液侵染后12h青蛤血淋巴中表达量即达到峰值,随后表达量逐渐降为正常水平.

青蛤MAPK/p38基因的克隆及Poly:Ic胁迫下的表达分析

[目的]克隆青蛤MAPK/p38基因,并分析其在Poly:Ic胁迫下的表达情况。[方法]利用转录组测序获得青蛤MAPK/p38基因的序列信息,采用生物信息学软件分析该基因在近缘生物间的进化关系;利用巢式及荧光定量PCR技术克隆青蛤MAPK/p38基因的结构域序列,并在Poly:Ic胁迫后立即分析该基因在青蛤各组织中的表达情况以及血淋巴中的时序性表达情况。[结果]克隆得到青蛤MAPK/p38基因的结构域序列,分析发现该基因在物种进化中很保守,其在青蛤的血淋巴、肝脏、外套膜、闭壳肌和鳃中均有表达,其中在血淋巴中表达量最高,腮中表达量最低。Poly:Ic胁迫3 h后该基因的表达量达到最大值,与对照组差异极显著(P<0.01)。[结论]MAPK/p38基因所表达的产物是青蛤重要的免疫信号通路蛋白。