小鼠激素敏感性脂肪酶基因启动子报告质粒的构建

目的拟构建激素敏感性脂肪酶(HSL)基因启动子报告质粒。方法将以C57BL/6小鼠基因组DNA为模板扩增的小鼠HSL基因启动子序列,插入pGL4.10-basic荧光素酶报告质粒多克隆位点区域,再经PCR、限制性酶切和测序分析筛选出目标质粒pGL4.10-basic-HSL,采用荧光素酶活性分析评价质粒的转录活性。结果启动子插入片段长度正确,序列与数据库一致;目标报告质粒转入293T细胞后,在过氧化物酶体增殖物激活受体γ作用下具有转录活性,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建HSL基因启动子报告质粒。

人体摄入紫菜后尿中砷化物的排泄规律研究

目的观察正常人摄入紫菜后,尿中不同形态砷化物随时间的排泄规律。方法收集24名受试者(14名男性,10名女性)食入紫菜后72h内不同时点的尿液,采用高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光分光光度法(HPLC-HG-AFS)检测尿中砷代谢产物的形态与浓度。结果在食用紫菜后72h内,与食用紫菜前比较,男性除第1和48h外,尿中iAs浓度均显著增高(P<0.05);除第1和12h外,尿中一甲基胂酸(MMA)浓度显著增高(P<0.05);第1～72h尿中二甲基胂酸(DMA)浓度显著增高(P<0.05);女性受试者食用紫菜后,除第3、5和48h外,尿中iAs浓度明显增高(P<0.05);除第5和12h,尿中MMA浓度均显著增高(P<0.05);第1～72h尿中DMA浓度均有显著增高(P<0.05)。食用紫菜后,女性尿中DMA浓度显著高于男性。结论摄入相同剂量紫菜后女性尿中DMA浓度显著高于男性,并且DMA浓度随时间先升高后降低。

食用海产品后人体尿砷代谢产物特点的研究

目的观察食用紫菜后的志愿者尿中各形态砷和尿总砷(TAs)的随时间的变化规律及其对尿TAs的影响。方法志愿者禁食海产品至少72h,收集食用紫菜后第1、3、5、8、12、24、36、48、60、72小时尿样;运用横断面调查方法,随机采集某渔村55名居民尿样,所有尿样采用冷阱捕集-氢化物发生原子分光光度法检测尿中各形态砷[一甲基砷(MMA)和二甲基砷(DMA)]和TAs含量。结果志愿者食用紫菜后,尿TAs随时间的延长而上升,在第36小时达到高峰,然后随时间的延长而下降,尿中DMA的变化同尿TAs的变化一致。食用紫菜后36h内女性尿中DMA的含量高于男性(P<0.05),TAs排泄高峰时间早于男性12h。渔村居民尿中MMA、DMA和尿TAs显著高于对照组居民,渔村居民尿中特异性地检出了三甲基砷(TMA)。结论志愿者食用海产品后,尿TAs会有显著的上升且尿TAs中以DMA的变化为主。女性对海产品中的砷化物的代谢和排泄能力高于男性。渔村居民尿中DMA和TMA为尿TAs的主要组成部分。

无机砷对Chang liver细胞血红素单加氧酶-1表达的活化作用

目的观察无机砷（NaAsO2）对正常人肝细胞株Changliver细胞血红素单加氧酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1）表达的活化作用。方法采用细胞培养的方法，将Changliver细胞分别暴露于10μm01／LNaAsO：后0（对照）、2、6、12、24h和0（对照）、5、10、25、50μmol／L后12h，收集细胞，Westernblot技术检测细胞内HO-1蛋白的表达。结果Changliver细胞染砷10μmol／L，体外培养6、12、24h，细胞内HO-1蛋白表达（3．97±0．72、12．92±2．98、23．29±3．82）明显高于对照组（1．00±0．00），组间比较和各组分别与对照组比较，差异有统计学意义（F=85．83，P〈0．01；￡值分别为-9．42、-8．95、-13．83，P〈0．05或〈0．01）。染砷5、10、25、50μmol／L．体外培养12h，细胞内HO-1蛋白表达（6．34±0．25、7．75±0．39、7．93±0．14、12，48±0．35）明显高于对照组（1．00±0．00），组间比较和各组分别与对照组比较，差异有统计学意义（F=709．66，P〈0．01；t值分别为-36．25、-30．19、-86．40、-56．40，P〈0．01）。结论无机砷能够诱导ChangLiver细胞内HO-1的活化，促进蛋白表达，并且具有时间和剂量效应。

CD34阳性表皮干细胞对砷急性细胞毒性的耐受力分析

目的研究CD34阳性(CD34^+)表皮细胞的干细胞特性及其对亚砷酸钠(NaAsO_2)急性细胞毒性的耐受力,为利用干细胞模型进一步探索砷的致癌机制奠定基础。方法用免疫磁珠法从HaCaT细胞中分选CD34^+细胞,用流式细胞术检测CD34^+细胞的富集率,观察细胞的全克隆形成能力,用实时荧光定量PCR(reverse transcript quantitative PCR,RTq PCR)检测CD34^+细胞和未分选的HaCaT细胞(对照细胞)中干细胞标记物(CD34、p63、K5、K14、OCT4,SHH)以及药物转运基因(ABCC1、ABCC2、ABCG2)、解毒酶基因(GST-Pi)、抗氧化基因(NRF2、HO-1、GCLC)的表达水平;将CD34^+细胞和对照细胞用0~150μmol/L NaAsO_2处理24 h,以MTS法检测细胞活力。结果经免疫磁珠分选后,CD34^+细胞富集率从0.10%±0.05%升至88.6%±2.5%(P<0.001);CD34^+细胞全克隆形成数量为对照组的2.4倍(P<0.01),CD34、p63、K5、K14、OCT4和SHH等干细胞标志物基因在CD34^+细胞中的转录水平显著升高(P<0.05),分别为对照细胞的(18.20±2.81)倍、(2.21±0.07)倍、(1.60±0.13)倍、(3.89±0.05)倍、(2.27±1.34)倍和(4.18±0.91)倍;在20~150μmol/L NaAsO_2浓度范围内,CD34^+细胞的细胞活力显著高于对照组(P<0.05),NaAsO_2对CD34^+细胞和对照细胞的半数致死量(LC50)分别为98.3μmol/L和50.1μmol/L;CD34^+细胞中ABCC1、ABCC2和ABCG2等药物转运基因的mRNA水平显著高于对照组(P<0.05),分别为对照组的(3.00±0.30)倍、(1.23±0.30)倍和(2.59±0.38)倍;解毒酶GST-Pi的mRNA水平为对照组的(2.19±0.56)倍;NRF2、HO-1和GCLC等抗氧化基因在CD34^+细胞中的转录水平显著高于对照组(P<0.05),分别为对照组的(2.22±0.23)倍、(2.59±0.36)倍和(2.19±0.24)倍。结论 CD34^+细胞具备一定的表皮干细胞特性且对NaAsO_2的急性细胞毒性具备更高的耐受力。

破骨细胞分化增强参与慢性砷暴露导致的小鼠骨密度下降

目的研究慢性饮水型砷暴露对小鼠长骨骨密度的影响及其相关机制。方法将5月龄雌性C57BL／6小鼠按体质量采用随机数字表法分为假手术组和摘除卵巢（去势手术）组，每组19只。每组分为3个亚组：①对照：饮用蒸馏水（rt=6）；②5mg／L砷处理：饮用蒸馏水中含三价无机砷（iAsⅢ）和五价无机砷（iAsⅢ）各2．5mg／L（n=7）；③20mg／L砷处理：饮用蒸馏水中含iAs“和iAsⅢ各10mg／L（n=6）。自由进食和饮水饲养3个月后，采用双能X射线检测小鼠股骨骨密度。体外实验处理条件：①0．00、0．25、0．50、0．75、1．00、1．50μmol／LiAsⅢ处理单核巨噬白血病（RAW264．7）细胞系或0．0、0．2、0．4、0．6、0．8、1．0μmol／LiAsⅢ处理原代培养小鼠骨髓造血干细胞6d，同时给予50μg／L核因子KB受体活化因子配体（RANKL）和30μg／L巨噬细胞集落刺激因子（M．CSF）进行诱导分化。②根据iAsⅢ处理RAW264．7细胞系诱导分化破骨细胞数量检测结果，选择0．6Ixmol／LiAsⅢ处理组，同时给予0（对照）、5、10mmol／L氧化抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）。采用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色观察iAsUI和NAC对破骨细胞分化的影响。结果①与假手术对照组[（84．44±4．40）mg／cm2]相比，假手术20mg／L砷处理组小鼠股骨骨密度[（80．04±4．06）mg／cm2]呈下降趋势，而去势手术对照组[（76．36±3．36）mg／cm2]明显下降（P〈0．05）；与去势手术对照组比较，去势手术5、20mg／L砷处理组未见明显变化[（77．74±4．91）、（75．56±3．71）mg／cm2,P均〉0．05]。②体外实验显示，在原代培养骨髓造血干细胞向破骨细胞诱导分化过程中，各iAsⅢ处理组破骨细胞数量比较，差异有统计学意义（F=1522，P〈0．05），0．50μmol／LiAsⅢ处理组破骨细胞数量达峰值；在RAW264．7细胞向破骨细胞诱导分化过程中，各iAsⅢ处理组破骨细胞数量比较，差异有统计学意义（F=1781，P〈0．05），0．6μmol／LiAsⅢ处理组破骨细胞数量达峰值；诱导分化低剂量iAsⅢ（0．6μmol／L）暴露RAW264．7细胞时，各NAC处理组破骨细胞数量比较，差异有统计学意义（F=1940，P〈0．05），且随NAC浓度升高，破骨细胞数量明显下降（109．33±3．06、56．00±2．65、22．67±0．58，P均〈0．05）。结论砷暴露对骨代谢的影响具有明显的卵巢功能依赖性，提示砷可能是通过干扰雌激素代谢或功能影响骨代谢。另外，砷暴露引发的氧化应激促进破骨细胞分化，且破骨细胞分化增强可能参与慢性砷暴露导致的骨密度下降，提示抗氧化剂的干预可能有效防治砷暴露引发的骨质疏松。