双氢青蒿素通过激活氯通道促进鼻咽癌CNE-2Z细胞放疗敏感性

目的:探讨ClC-3氯通道在双氢青蒿素(DHA)促进鼻咽癌CNE-2Z细胞放射增敏中的作用。方法:MTT法检测DHA对CNE-2Z细胞和正常鼻咽上皮NP69-SV40T细胞活力的抑制作用;集落形成实验检测DHA对CNE-2Z细胞的放射增敏作用;Western blot检测ClC-3蛋白的表达;siRNA技术下调ClC-3蛋白的表达;全细胞膜片钳技术记录细胞氯电流。结果:(1)相较于NP69-SV40T细胞,DHA可选择性抑制CNE-2Z细胞活力,IC_(10)值分别为(13.020±4.831)μmol/L和(5.244±1.050)μmol/L(P<0.01);(2)集落形成实验结果显示,DHA对CNE-2Z细胞具有放疗增敏作用,放射增敏比为1.9;(3)DHA能激活CNE-2Z细胞的氯通道,产生外向氯电流;但对NP69-SV40T细胞的氯通道则无影响;(4)DHA促进CNE-2Z细胞的ClC-3氯通道蛋白的表达(P<0.01);(5)氯通道阻断剂NPPB可抑制DHA对CNE-2Z细胞的放射增敏作用,抑制比达1.84;同时也抑制DHA激活的氯电流;(6)下调CNE-2Z的ClC-3蛋白可抑制DHA对鼻咽癌CNE-2Z细胞的放射增敏作用,抑制比达4.19;DHA对CNE-2Z细胞的氯电流的激活作用则不再产生。结论:DHA对鼻咽癌CNE-2Z细胞产生放疗增敏作用,很可能与ClC-3氯通道被激活有关。

天然冰片通过触发铁死亡增强他莫昔芬对人乳腺癌T47D细胞的杀伤作用

目的:探讨天然冰片(NB)增强人乳腺癌T47D细胞对他莫昔芬(TAM)的敏感性及其机制。方法:以6.25~800μmol/L梯度浓度的NB与20μmol/L TAM联合作用于体外培养的T47D细胞,处理时间为24 h,MTT实验检测细胞活力并计算TAM的半数抑制浓度(IC50),集落形成实验测定细胞集落形成率,以评估NB对TAM的增敏效应,并以流式细胞术检测NB联用TAM条件下细胞周期分布和凋亡率的变化。20μmol/L TAM与400μmol/L NB联合作用于T47D细胞24 h,以流式细胞术检测线粒体膜电位(MMP)和细胞活性氧(ROS)水平;比色法检测胞内谷胱甘肽(GSH)浓度;Western blot法检测铁死亡相关蛋白核因子E2相关因子2(Nrf2)、胱氨酸/谷氨酸反向转运体(xCT)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的表达水平,以评估NB联合TAM是否引起T47D细胞铁死亡。以ROS抑制剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)或铁死亡抑制剂ferrostatin-1(Fer-1)进行预处理,MTT实验检测细胞活力并计算TAM的IC50,评估主动干扰铁死亡是否影响NB增强TAM的细胞杀伤作用。结果:(1)联用NB可促进TAM对T47D细胞的杀伤作用:NB(200和400μmol/L)与TAM联用导致TAM对T47D细胞的IC50降低(P<0.01);细胞集落形成率受到抑制(P<0.01);400μmol/L NB联合20μmol/L TAM可诱导T47D产生细胞周期S期阻滞(P<0.05)和增加细胞凋亡(P<0.01),晚期凋亡细胞占凋亡细胞的(78.0±6.8)%,而早期凋亡细胞仅占(22.0±6.8)%。(2)400μmol/L NB联合20μmol/L TAM触发T47D细胞铁死亡,表现为ROS积累增加(P<0.01)、MMP降低(P<0.01)、GSH浓度降低(P<0.01)以及铁死亡相关蛋白Nrf2、xCT和GPX4表达下调(P<0.05)。(3)1μmol/L NAC及1μmol/L Fer-1均可逆转NB联合TAM诱导的T47D细胞增殖抑制(P<0.01)。结论:NB联合TAM通过触发T47D细胞铁死亡的机制,增强TAM对人乳腺癌T47D细胞的杀伤作用。

双氢青蒿素激活LNCaP细胞氯通道并抑制细胞增殖

目的:探讨双氢青蒿素(DHA)通过氯离子通道抑制前列腺癌LNCaP细胞增殖的作用及其机制。方法:采用噻唑蓝(MTT)法检测DHA抑制LNCaP细胞增殖,并确定其半抑制浓度(IC 50值):分别配制的浓度梯度为0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000、80.000、160.000μmol/L DHA溶液,并按实验设计加入含有LNCaP细胞的96孔板中,在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光度(A)值;全细胞膜片钳:检测DHA激活LNCaP细胞氯电流以及氯通道抑制剂4,4’-二异硫氰酸基-2,2’-二苯乙烯磺酸二钠(DIDS)和5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸(NPPB)抑制LNCaP细胞氯离子电流。依次用0、±40 mV、±80 mV电脉冲刺激细胞,每个刺激间隔时间为200 ms,每个周期间隔为4 s。开始刺激后的10 ms收集和测量电流。通过将电流归一化到膜电容来确定电流密度。组间比较使用独立样本t检验。结果:DHA能够抑制LNCaP细胞增殖,其抑制效果具有时间依赖性,DHA抑制LNCaP细胞增殖的IC 50值随时间延长逐渐降低。在用DHA处理LNCaP细胞24、48、72 h后,其IC 50值分别为(51.34±1.49)、(24.98±2.07)、(22.79±1.38)μmol/L[n=3,t=17.901(24 h比48 h),t=24.349(24 h比72 h),P<0.01]。此外,DHA也能激活LNCaP细胞氯通道产生氯电流,在80 mV电压钳制下,LNCaP细胞的电流密度增加至(48.30±7.52)pA/pF,被激活的电流可被氯通道抑制剂抑制至(6.35±2.47)pA/pF(DIDS)和(9.25±2.09)pA/pF(NPPB)[n=3,t=9.180(DHA比DIDS),t=8.666(DHA比NPPB),P<0.01]。结论:DHA能够抑制前列腺癌LNCaP细胞增殖,其抑制效果具有时间依赖性;DHA也能够激活LNCaP细胞氯离子通道产生氯离子电流,且激活的氯电流能够被氯通道抑制剂所抑制。