三种测定蛋白质热稳定性方法的比较

蛋白质的热稳定性一般使用热变性中点温度(melting temperature,T_(m))来表示,即蛋白质解折叠50%时的温度.测定蛋白质T_(m)值的常用方法有差示扫描量热法(differential scanning calorimetry,DSC)、圆二色光谱法(circular dichroism,CD)和差示扫描荧光法(differential scanning fluorimetry,DSF)等.为了比较不同方法的检测特点和效果,选择了5种具有不同结构特点的蛋白,分别使用上述方法对其T_(m)值进行测定.结果发现,三种方法测得的T_(m)值整体上较为一致,但也存在一定的差异.研究还发现,结构更复杂的蛋白,并不一定具有更多T_(m)值.

一种人B淋巴细胞表面抗原的重组表达和纯化

人源CD20作为B淋巴细胞表面特异性表达的膜蛋白,可以作为B淋巴细胞瘤免疫治疗的有效靶点。通过分子克隆引物设计,将CD20的胞外区以重复串联的方式克隆到pET28a载体上,两者之间通过Linker连接区(-GSSGGSSG-)连接,构建表达载体pET28a-Bi20。测序正确后转化至大肠杆菌Transetta(DE3)中重组表达,优化表达条件为当菌液OD_(600)为0.6~0.8时,以IPTG终浓度1 mmol/L,37℃诱导5 h。表达产物带有C端6个组氨酸的亲和标签,以包涵体形式表达。通过包涵体洗涤条件优化,变性条件下的镍亲和层析纯化,透析复性条件的摸索和优化,最终获得纯度大于95%的可溶CD20胞外区同源二聚体Bi20,建立在大肠杆菌表达系统中规模化量产CD20胞外区多肽的方法。经Western Blot和ELISA检测证实纯化复性后CD20胞外区多肽Bi20具有良好的免疫原性。