感染旋毛虫小鼠腹腔巨噬细胞TLR4及细胞因子的变化

为研究旋毛虫感染对小鼠腹腔巨噬细胞Toll样受体4(TLR4)及细胞因子的影响,本研究分别取感染前、后不同时期小鼠腹腔巨噬细胞,采用半定量PCR和流式细胞术检测巨噬细胞TLR4的表达量,western blot检测TLR信号传导相关蛋白MyD88和NF-κB相对表达量,并对巨噬细胞培养上清液细胞因子浓度进行测定。结果显示,巨噬细胞TLR4在基因和蛋白水平上表达量变化趋势基本一致,呈双峰状,峰值分别在感染后4 d和21 d:旋毛虫感染初期4 d左右TLR4表达升高,之后降低,14 d左右至最低点,感染后期21 d左右TLR4表达重新升高,然后降低并趋于稳定。MyD88/NF-κB的相对表达量及炎性因子含量变化趋势与巨噬细胞TLR4表达量变化趋势相似。由此表明,小鼠腹腔巨噬细胞TLR4的表达与旋毛虫生活史的不同阶段及抗原密切相关,在旋毛虫不同时期抗原刺激下,经由TLR4/MyD88/NF-κB传导途径活化细胞,继而引起炎性因子分泌发生变化。

感染旋毛虫小鼠不同时期TLR2/TLR4 mRNA表达量及血清炎性因子的变化

目的探讨旋毛虫感染对小鼠不同组织细胞TLR2/TLR4(Toll样受体)表达量及血清炎性因子的影响。方法分别取感染前、后不同时期小鼠心肌、肺及腹腔巨噬细胞,应用半定量PCR方法检测TLR2/TLR4mRNA相对表达量,同时应用ELISA方法对血清相关炎性因子进行检测。结果随着旋毛虫感染时间的变化,TLR4和TLR2在心肌、肺和腹腔巨噬细胞上的表达略有不同,但大致呈双峰状。旋毛虫感染初期4d左右,TLR2/TLR4mRNA表达均有不同程度升高,之后降低,14d左右,心肌与肺TLR升高,巨噬细胞TLR则继续下降,在21d左右,心肌TLR表达量达到最高值,且与对照组差异显著(P<0.05),肺组织TLR呈下降趋势,巨噬细胞TLR表达升高,之后下降并趋于稳定。感染鼠的血清中炎性因子IL-2和NO的表达量显著升高(P<0.05),而TNF-α、IL-10和IL-12的表达量则显著降低(P<0.05),IL-6的表达量变化不明显。结论旋毛虫感染可引起小鼠心肌、肺和巨噬细胞上的Toll样受体TLR2/TLR4表达发生变化,继而调节相关细胞因子分泌也发生变化,这种变化与旋毛虫生活史不同阶段抗原及其引起的宿主免疫反应和组织器官损伤具有一定相关性。

猪群常见细菌性疾病的防控

细菌性疾病对于猪群的危害严重,会导致猪只的成活率低,影响养殖户的经济效益,细菌性疾病以夏季最为多见,这是因为高温潮湿的环境非常适合细菌的滋生,加上夏季蚊虫多,更加易于传播致病菌,但其他季节也会有细菌性疾病发生。笔者重点探讨了几种常见的细菌性疾病及其防控措施,具体如下。

规模化猪场伪狂犬野毒感染的诊治与净化措施

猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的猪及多种哺乳类动物共患的一类急性病毒性传染病。对其进行控制和净化，对于猪厂伪狂犬疾病本身及防止其导致的继发感染均有重要意义，本文在参考先进国家伪狂犬病净化完成经历的根基上，通过实际的防控案例对国内某养猪场这个疫病的净化展开了论述。

传代细胞源猪瘟活疫苗与高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗GDr180株联合免疫的效果评价

旨在了解猪瘟(CSF)活疫苗(传代细胞源)与高致病性猪繁殖与呼吸综合征(HP-PRRS)活疫苗(GDr180株)同时免疫,是否存在免疫效力相互干扰作用。试验采用肌肉注射与喷鼻两种免疫接种方法,分别单独免疫猪瘟活疫苗(传代细胞源)和HP-PRRSV活疫苗(GDr180株)以及同时免疫这两种疫苗。在免疫前,免疫后14、21、28 d分别采血分离血清并检测相应抗体,对比单独免疫分别接种和同时免疫联合接种两种疫苗,分析其抗体产生期和免疫效果的差异。抗体检测结果显示:两种疫苗通过肌肉注射或喷鼻免疫方法,不论单独接种还是联合接种,免疫后不同时间点的血清抗体阳性率、离散度、平均值,均无显著差异,说明传代细胞源猪瘟活疫苗与HP-PRRSV活疫苗GDr180株同时免疫,免疫效力不会相互干扰。

小鼠TLR2的克隆表达及生物学活性分析

采用RT-PCR方法从小鼠巨噬细胞中扩增Toll样受体2(mTLR2)基因,得到基因全长CDS,经克隆测序正确后构建真核表达质粒pcDNA3.1-mTLR2。重组质粒瞬时转染HEK293T细胞,分别用RT-PCR与免疫荧光检测其表达及细胞定位。利用TLR2激活物pam3csk4刺激转染重组质粒的HEK293T细胞后,用双荧光素酶报告基因系统分析其下游转录因子NF-κB的转录活性。结果显示,mTLR2转染后成功表达并定位于细胞膜,pam3csk4刺激后荧光素酶活性显著高于生理盐水对照组,说明表达的mTLR2具有野生型分子的功能。本研究成功克隆与表达了mTLR2基因且表达产物具有生物学活性,为研究TLR2信号通路及其在抗寄生虫感染中的作用奠定了基础。

旋毛虫ES抗原对小鼠巨噬细胞TLR2/4mRNA表达的影响

为探讨旋毛虫ES抗原对RAW264.7细胞TLR2/4mRNA表达的影响,分别取经0、2、5、15、30、45μg/mL ES抗原作用24h的RAW264.7细胞和用15μg/mL ES抗原作用0、3、6、12、18、24h后的RAW264.7细胞,采用半定量PCR方法检测TLR2和TLR4mRNA的表达水平变化。结果显示,随着ES抗原浓度的升高,TLR2/4mRNA的表达量逐渐上升,15μg/mL ES抗原组与空白对照组相比差异显著(P<0.05)。在15μg/mL ES抗原作用24h内,随着作用时间的延长,TLR2/4mRNA的表达量逐渐上升,作用18h后的表达水平升高,且与空白对照组差异显著(P<0.05)。证实,ES抗原可刺激RAW264.7细胞表面受体TLR2/4表达升高,且存在一定的剂量和时间效应。

旋毛虫HSP70基因的原核表达及其免疫原性

利用RT-PCR方法扩增旋毛虫HSP70基因,将其扩增产物克隆到pEASY-Blunt Simple载体中,经限制性酶切后与pET-28a(+)载体连接,进一步转化至感受态细胞Transetta(DE3)中,用IPTG诱导表达重组旋毛虫HSP70。以纯化的重组HSP70制备多克隆抗体,并对HSP70进行免疫印迹分析及免疫组织化学染色。结果表明,重组质粒的鉴定和DNA测序均正确;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在70ku处获得一目的条带;免疫组织化学染色结果显示,该HSP70具有很好的免疫原性。证实,成功构建了重组表达质粒pET28a-HSP70,为深入研究旋毛虫HSP70的功能奠定了基础。

旋毛虫p43与p53核酸疫苗的构建及其免疫保护性

为探讨旋毛虫p43、p53基因的核酸疫苗对小鼠的免疫保护效果与免疫保护机制,将p43、p53基因分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,分3次肌肉注射免疫3组昆明小鼠。于三免后2周经口感染旋毛虫肌幼虫(100蚴/只),在攻虫后第7天和第35天剖杀小鼠,计算成虫减虫率、肌幼虫减虫率和繁殖力指数,评估其免疫效果。在各时间点上取小鼠血清用于检测抗体水平和脂肪酸结合蛋白(H-FABP)。结果显示,试验各组成虫减虫率与对照组相比差异显著(P<0.05),LPG及RCI减虫率与对照组相比均差异极显著(P<0.01);IgG抗体水平提高,与PBS组差异显著(P<0.05);各组H-FABP检测结果均低于70pg/mL。结果表明旋毛虫p43与p53基因的核酸疫苗具有较好的抗旋毛虫的免疫保护效果,且两核酸疫苗对小鼠心肌无损伤。