山葡萄转录因子VaMYB4a互作蛋白的筛选与鉴定

以抗寒种质山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)‘左山-1’叶片组织为试材,通过Gateway技术构建酵母均一化cDNA文库,库容量为1.36×10^(7)cfu∙mL^(-1),外源基因插入片段均大于1 kb,重组率为100%,符合后续试验要求。以VaMYB4a^(113-252)C端调控区段为诱饵,经酵母双杂交筛选获得17个候选互作蛋白,选取2个与非生物胁迫应答密切相关的候选互作蛋白分别在酵母、拟南芥原生质体中进行互作验证,发现锌指类转录因子VaCOL4、VaCOL5均与VaMYB4a全长及VaMYB4a113-252存在互作关系。经系统进化与蛋白保守结构域分析,推测葡萄COL基因家族中VaCOL2与VaMYB4a具有潜在互作关系,进而通过BiFC验证表明,VaCOL2与VaMYB4发生蛋白互作;顺式作用元件预测表明VvCOL2、VvCOL4与VvCOL5启动子区包含多个激素及逆境应答相关元件,其中VvCOL2包括多个低温响应元件(LTRE);低温胁迫下,VaMYB4a、VaCOL4与VaCOL5具有相同的表达模式,但VaCOL2表达模式不同。综上,VaMYB4a可与VaCOL2、VaCOL4及VaCOL5互作形成蛋白复合体以协同或拮抗的方式调控植物低温胁迫应答。

‘赤霞珠’葡萄未成熟合子胚的体细胞胚发生研究

为建立‘赤霞珠’葡萄(Vitis vinifera ‘Cabernet Sauvignon’)体细胞胚再生体系,以花后80 d未成熟合子胚为外植体,探究了促进初生胚萌发的最佳处理方式以及激素组合对次生体细胞胚直接与间接发生的影响。采用不同浓度(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g·L^(-1))赤霉素处理、不同时长(2、5、10、15、30 min)超声处理、不同破皮方式(切割种背、切喙+切割种背、磨砂)处理诱导初生胚,进而将已获取初生胚的子叶、胚轴、胚根分别切段放置于添加4种不同浓度的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D;0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L^(-1))和6-苄氨基嘌呤(6-BA;1.0、2.0、3.0、4.0 mg·L^(-1))组合的MS培养基中循环诱导次生胚。结果表明:在初生胚诱导中, 2.5 g·L^(-1)赤霉素、超声2 min、切喙+切割种背三种处理可大幅提高初生胚的诱导率, 11 d时诱导率分别为97.28%、98.64%与92.47%,对照组仅68.42%;在次生胚诱导中,添加0.5、1.0、1.5 mg·L^(-1)2,4-D和1.0、2.0、3.0 mg·L^(-1)6-BA的MS培养基有利于愈伤组织增殖并可通过间接途径产生体胚, 90 d时诱导率在6.45%~17.15%之间。在添加4种不同浓度2,4-D和6-BA组合的MS培养基中, 2.0 mg·L^(-1)2,4-D和4.0 mg·L^(-1)6-BA组合的体细胞胚诱导率最高, 90 d成胚率达到21.33%,次生胚在子叶褐化处直接形成。94%的正常次生胚可萌发并再生植株,生根率达100%。本研究所建立的‘赤霞珠’未成熟合子胚体细胞胚诱导方法为葡萄属植物再生体系优化完善和遗传转化应用研究提供参考依据。

葡萄E3泛素酶HOS1基因克隆、表达及抗血清制备

HOS1(High expression of osmotically responsive genes 1)编码1个具有E3泛素连接酶活性的蛋白,是模式植物拟南芥冷反应信号转导途径的关键负调控因子,但其在多年生葡萄属植物中参与低温胁迫应答的分子机制尚不明确。以欧洲酿酒葡萄品种‘霞多丽’的叶片为供试材料,克隆了VvHOS1基因,其全长2931bp,编码976个氨基酸,在第74~106个氨基酸处存在RING类型的锌指结构域(zf-C3H43)。系统发育分析表明,葡萄属植物的HOS1蛋白与番茄、烟草、茶树的亲缘关系最近。将VvHOS1抗原表位丰富肽段(1~320 aa)构建至原核表达载体pET28a-SUMO的BamHⅠ与HindⅢ位点,转化大肠杆菌。经IPTG诱导发现,pET28a-VvHOS11-320在大肠杆菌Rosetta(DE3)中高表达,融合蛋白主要以包涵体形式存在。将纯化后的重组蛋白作为抗原免疫大耳白兔,获得anti-VvHOS1多克隆抗体,ELISA检测效价为1︰51200,具有较强的Western特异性。该抗血清能够特异性检测‘霞多丽’葡萄叶片中的VvHOS1蛋白。(4℃)低温胁迫6、36与48 h时VvHOS1上调表达显著。