miRNA的生物学特性和功能

近年来,在小分子RNA中发现了一类与基因表达调节密切相关的分子—微RNA(miRNA)。miRNA是一类真核生物内源性小分子单链RNA,长度通常为21～22个核苷酸,能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译,从而对基因进行转录后表达的调控。miRNA具有控制基因表达及细胞分化、增殖和凋亡等多种功能,可能对基因功能研究、人类疾病防治及生物进化探索有重要意义。该文对miRNA的生物学特性及功能进行综述。

CgCDR1多克隆抗体制备、鉴定与应用

目的:制备特异性光滑假丝酵母耐药基因CDR1(CgCDR1)的多克隆抗体,为深入研究CgCDR1在介导光滑假丝酵母耐药中的作用奠定基础。方法:根据生物信息学分析预测CgCDR1蛋白的二级结构、亲水性及抗原性等理化特性,以这些分析预测为依据,经过同源性检索后设计出一段由14个氨基酸组成的多肽,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体。用ELISA、Western blot方法检测该抗体的效价和特异性,并用Western blot方法检测CgCDR1在配对光滑假丝酵母菌中的表达情况。结果:ELISA法检测所制备抗体的效价达1∶5 000;Western blot结果显示该抗体能与CgCDR1蛋白特异结合。CgCDR1在氟康唑耐药的光滑假丝酵母菌中的表达量明显高于配对的氟康唑敏感的光滑假丝酵母菌。结论:制备的CgCDR1多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性,该多克隆抗体可用于CgCDR1的免疫活性鉴定,为深入研究该蛋白在光滑假丝酵母耐药中的作用奠定了基础。

3种念珠菌对氟康唑耐药的易感性及耐药机制比较

目的研究比较3种念珠菌对氟康唑耐药的易感性及其体外诱导耐药株的耐药机制。方法选取同一患者中同时分离的对氟康唑敏感的白念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌各1株,在体外氟康唑的作用下诱导其成为耐药株。采用罗丹明6G试验比较敏感株与耐药株的外排泵作用,RT-PCR检测外排相关基因CDR1、CDR2以及靶酶编码基因ERG11的表达,并对ERG11基因进行PCR扩增和测序,同时通过罗丹明123试验对3种念珠菌的线粒体膜电位(ΔΨm)进行检测。结果光滑念珠菌最易被氟康唑诱导为耐药株,其CDR1的过度表达引起外排泵作用增强。白念珠菌和热带念珠菌的诱导耐药株以ERG11表达增加为主,其中白念珠菌的ERG11存在V437I、A430V、S263L和T128K突变位点。此外,白念珠菌和光滑念珠菌的诱导耐药株表现为呼吸缺陷。结论不同念珠菌对氟康唑耐药的易感性不同,耐药机制也存在差异。

热CO_2气腹对结肠癌细胞的杀伤作用

目的体外研究热CO2气腹对结肠癌细胞的杀伤作用，探讨其作为结肠癌腹膜转移处理新方法的可能性。方法建立体外热CO2气腹实验模型，WST-8法检测热CO2气腹（42℃-44℃，2—4h）对结肠癌细胞株COLO205的细胞毒作用；流式细胞术、Hoechst 33342／PI荧光显微镜、透射电镜等明确细胞死亡机制；PT100温标及pH计检测细胞外环境温度和pH值改变；细胞外酸化抑制试验明确细胞外酸化的作用。结果细胞毒检测表明热CO2气腹对COLO205细胞有显著的杀伤作用；流式细胞术及细胞形态学观察表明，诱导细胞凋亡是其主要作用方式。热CO2作用后细胞外环境pH值从7．4降低至6．7；羟乙基哌嗪乙磺酸抑制细胞外酸化可显著抑制细胞杀伤。结论热CO2气腹通过诱导细胞凋亡杀伤结肠癌细胞；细胞杀伤作用与热作用及CO2酸化增敏有关。热CO2气腹具有应用于结肠癌腹膜转移处理的潜质。

MAGE-3逆抗原转染树突状细胞的抗胃癌免疫效率

目的构建逆抗原表达载体,以获得理想的肿瘤疫苗。方法运用RT-PCR方法合成MAGE-3cDNA,分别将RANTES基因分泌段前导序列和受体Fc段克隆至MAGE-3cDNA两端(pS-MAGE-3-Fc)再转染入DC表达,将致敏的DC与外周血T细胞和胃癌细胞共培养,观察产生的免疫效应。结果转染pS-MAGE-3-Fc的DC诱导的刺激淋巴细胞增殖反应和CTL杀伤效应均显著高于转染pMAGE-3的转染组和对照组(P<0.05)。结论逆抗原策略是理想的肿瘤疫苗策略,能够显著提高肿瘤免疫效率。

TAGLN在胃癌组织中的表达及其与转移的关系

目的观察TAGLN在胃癌中的表达及其与肿瘤细胞侵袭转移能力的关系。方法运用实时PCR、Western blotting及免疫组化方法,检测TAGLN在40例胃癌患者肿瘤组织和相应癌旁组织、7株胃癌细胞株及癌相关成纤维细胞(CAFs)中的表达;分析TAGLN的表达与胃癌临床病理学之间的关系。运用细胞侵袭和移动试剂盒检测高表达TAGLN的CAFs或沉默TAGLN表达后的CAFs对胃癌细胞株MKN45侵袭及移动能力的影响。结果在mRNA和蛋白表达水平方面,各胃癌细胞株间无显著性差异(P>0.05);与相应癌旁组织相比,胃癌组织TAGLN的表达明显上调(P<0.05);免疫组化染色显示,TAGLN蛋白表达于胃癌组织间质中的成纤维细胞、新生血管内皮细胞及肿瘤浸润的黏膜肌层中的肌细胞,且主要表达于细胞膜和细胞浆。淋巴结转移组胃癌组织TAGLN蛋白的表达为3.751±0.681,显著高于无淋巴结转移组的1.084±0.328(P<0.05)。细胞侵袭和移动试验结果显示,高表达TAGLN的CAFs能够促进胃癌细胞株MKN45的侵袭及移动能力;而经siRNA沉默TAGLN表达后的CAFs则明显降低胃癌细胞株MKN45的侵袭及移动能力。结论TAGLN基因在胃癌组织的基质中高表达,其表达上调对胃癌的侵袭和转移可能具有促进作用。

热CO_2气腹对结肠癌细胞的增殖抑制作用及其机制

目的:探讨热CO2气腹对结肠癌细胞的增殖抑制作用及作用机制,明确其用于结直肠癌腹膜转移治疗的可行性。方法:建立热CO2气腹体外实验模型,热CO2气腹(43℃,2～4h)作用于结肠癌细胞株COLO205细胞。以WST-8法检测细胞增殖,Annexin-V/PI流式细胞术及透射电镜检测细胞死亡,流式细胞术检测细胞周期。结果:热CO2气腹(43℃,2～4h)对结肠癌细胞有显著的增殖抑制作用,热CO2显著诱导细胞凋亡及G1期细胞阻滞。结论:热CO2气腹通过诱导细胞凋亡及G1期细胞周期阻滞显著抑制结肠癌细胞的增殖,热CO2气腹具有应用于结直肠癌腹膜种植转移治疗的潜能。

Tau基因表达与紫杉醇治疗胃癌敏感性的研究

目的:探讨胃癌细胞的Tau基因表达丰度与紫杉醇治疗敏感性间的关系,并分析其可能的耐药机制。方法:通过实时定量PCR筛选出Tau基因高表达和低表达的胃癌细胞株各一,然后观察两细胞株对紫杉醇的反应;并应用细胞增殖实验(CCK8方法)、流式细胞技术(AnnexinⅤ标记)检测紫杉醇在体外对胃癌细胞增殖、凋亡和周期的影响。对于Tau基因高表达的胃癌细胞,通过小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)等技术,观察其敲低Tau基因表达后,对紫杉醇的敏感性有无变化。结果:体外增殖实验显示,紫杉醇对Tau表达低的胃癌细胞的增殖生长抑制作用更为明显(P<0.05)。而体外凋亡实验显示,紫杉醇更能促进Tau基因低表达胃癌细胞的凋亡(P<0.05),在整个细胞周期中以G2/M期为主。而应用siRNA技术将Tau基因高表达的胃癌细胞降为低基因表达后,紫杉醇对其增殖的抑制作用明显增高(P<0.05),更能促进转染后细胞的凋亡(P<0.05);且对整个细胞周期,以作用于G2/M期为主。结论:紫杉醇对Tau基因表达低的胃癌细胞具有更强的增殖抑制作用,且更能促进其凋亡。而对干扰后的胃癌细胞,紫杉醇具有更强的抑制增殖作用,且更能促进其凋亡。

重复序列PCR与多位点分型技术在热带假丝酵母菌基因分型中的比较

目的分析比较重复序列聚合酶链反应(REP-PCR)与多位点分型技术(MLST)在热带假丝酵母菌基因分型中的应用。方法收集来自5个地区6家医院的147株热带假丝酵母菌,分别以Ca-21、Ca-22、Com-21两两组合为引物,选用最合适的引物对进行REP-PCR后通过电泳获得REP-PCR型。在不同型别中各挑选3株采用MLST法扩增热带假丝酵母菌的6个管家基因,扩增片段测序后与数据库比对得到相应的序列型(sequencetype,ST)。结果 REP-PCR以Com21-Com21为引物对分型效果最好,REP-PCR与MLST分型结果一致。147株热带假丝酵母菌产生A～H共8种REP-PCR型,分别对应MLST的ST146、新型1、ST136、ST127、ST177、ST169、新型2和ST117。结论 REP-PCR与MLST在热带假丝酵母菌的基因分型中分辨率相同,而REP-PCR更为方便迅速,可作为实验室大量菌株分型的首选方法。

沉默树突状细胞恒定链对其活力和分化成熟的影响

目的观察siRNA沉默树突状细胞(DCs)的恒定链(Ii)转染后对DCs活力及分化成熟的影响。方法从小鼠骨髓分离骨髓前体细胞,细胞经100ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和100ng/mL白细胞介素-4(IL-4)诱导培养6d后,转染针对DCsIi链特异的小分子干扰RNA(IisiRNA),转染后加用(或不加)50ng/mL肿瘤坏死因子-α(TNF-α)继续诱导成熟48h,分别通过Western blotting检测沉默效果,光镜观察DCs的活力和形态,流式细胞仪检测细胞的凋亡和表面分子标志(MHCⅡ、CD86、CD40),ELISA检测细胞IL-12p70的释放。结果IisiRNA能够明显抑制DCsIi的表达,转染IisiRNA后对DCs的活力、形态、细胞表型以及细胞因子IL-12p70的分泌均没有影响。结论通过siRNA沉默DCs的Ii链不会影响DCs的活力及分化成熟,该策略能够用于进一步的DCs肿瘤疫苗的研究。

脐血CD34^+细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增

目的探索脐血CD34+细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增、培养大量树突状细胞(DCs)的方法。方法Ficoll分离脐血单个核细胞,免疫微磁珠法分离纯化CD34+细胞,以rhIL-4、GM-CSF、rhSCF、rhFlt-3Ligand、TGF-β1及TNF-α体外诱导培养14d,进行形态学观察、表型检测及上清液IL-12测定。结果体外培养14d后,细胞呈现典型的成熟DCs形态学及表型特征:胞体表面粗糙,可见大量突起,高水平表达CD1a、CD11c、CD40、CD80、CD83、CD86和MHCⅡ类分子;同时,IL-12浓度随着培养时间的增加而升高,且在加入TNF-α刺激成熟后,IL-12浓度较未成熟时显著升高(P<0.05)。结论体外联合运用rhIL-4、GM-CSF、rhSCF、rhFlt-3Ligand、TGF-β1、TNF-α,能够成功诱导脐血CD34+细胞分化为大量活力好的DCs。

siRNA干扰沉默GS基因抑制胃癌细胞生长的研究

目的:利用RNA干扰技术,研究靶向Glutamine Synthetase(GS)基因的小干扰RNA(siRNA)在体外对胃癌细胞生长的影响,探索胃癌基因治疗并了解GS在胃癌发生、发展中的作用。方法:合成GSsiRNA,并用脂质体法将GSsiRNA转至胃癌BGC-823细胞中;采用实时定量PCR和Western印迹法观察GSsiRNA转染前后胃癌细胞GS基因及相应蛋白表达的变化;用CCK8、流式细胞检测技术分别检测胃癌细胞增殖及凋亡的变化。结果:转染GSsiRNA后的胃癌细胞BGC-823与对照组相比,生长明显变缓(P<0.05),细胞凋亡率明显增高(P<0.05)。结论:靶向GSsiRNA可明显下调靶基因GS的表达,在体外可抑制胃癌BGC-823细胞的生长并促进其凋亡。

血管内皮生长因子C与胃癌淋巴管生长关系的研究

目的:研究血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C)与胃癌淋巴管生长间的关系。方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),从人胃癌旁组织中扩增人VEGF-CcDNA全长,经T-A克隆酶切,鉴定并测序得到的完整序列后,进行亚克隆并构建pEGFP/VEGF-C真核表达载体,将其转染低表达VEGF-C的胃癌细胞株MKN45;另转染pEGFP空载体,作为对照组。通过体外G418抗生素筛选,得到高表达VEGF-C的肿瘤细胞克隆,用这种高表达VEGF-C的胃癌细胞与对照组细胞接种于裸鼠皮下(2组各为10只),观察肿瘤组织内淋巴管密度及裸鼠瘤体质量。结果:对照组和转染pEGFP/VEGF-C组肿瘤质量分别为(2.64±0.92)g、(5.55±0.81)g,差异有统计学意义(P<0.001);2组肿瘤组织内的淋巴管密度分别为9.77±1.12,13.87±1.29,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:VEGF-C能在胃肿瘤中促淋巴管生长。

miR-506对胃癌细胞增殖和转移的影响

目的探讨mi R-506对胃癌细胞增殖和转移的抑制作用。方法采用实时荧光定量PCR检测5株胃癌细胞系(MKN-45、SGC-7901、BGC-823、NCI-N87和AGS)中mi R-506的表达量,以永生化的正常胃黏膜上皮细胞GES-1为对照。通过脂质体转染的方法在SGC-7901细胞系中瞬时转染mi R-506和anti-miR-506上调和下调mi R-506表达,通过CCK-8实验观察细胞增殖能力改变,通过划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验观察细胞运动迁移和侵袭能力的变化。结果 miR-506在各胃癌细胞中的表达量相对于正常胃黏膜上皮细胞GES-1显著降低(P<0.05)。过表达mi R-506可显著抑制SGC-7901细胞的增殖、迁移和侵袭能力,与阴性对照的差异有统计学意义(P<0.01)。抑制mi R-506表达则可促进增殖、迁移和侵袭能力(P<0.01)。结论胃癌细胞系中mi R-506明显降低,上调mi R-506可以抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,下调则逆转上述过程。

下调MicroRNA-21对胃癌细胞生物学行为及PTEN表达的影响

目的:探讨抑制MicroRNA 21(miR-21)的表达对胃癌细胞的生物学行为及PTEN表达的影响,并分析miR-21参与肿瘤发生、发展的可能机制。方法:应用细胞瞬转的方法将miR-21 inhibitor转染课题组前期试验证实的miR-21高表达胃癌细胞株,应用细胞增殖试验(CCK8方法)、流式细胞技术(Annexin-Ⅴ标记)、Transwell试验检测抑制胃癌细胞株中miR-21表达后,对其细胞增殖、凋亡、周期、迁移的影响;并用Western印迹技术和双荧光素酶报告载体技术检测下调miR-21后,胃癌细胞株PTEN表达的变化。结果:体外增殖试验显示,下调miR-21后对胃癌细胞株的增殖抑制作用明显(P<0.05);体外凋亡试验显示,下调miR-21能增加胃癌细胞株的凋亡(P<0.05);在整个周期中以G1/S期为主;Transwell试验证实miR-21下调后,胃癌细胞株迁移能力明显下降(P<0.05);Western印迹试验显示,抑制miR-21表达后胃癌细胞株PTEN蛋白表达明显增加,荧光素酶相对活性明显增加(P<0.05)。结论:下调miR-21的表达对胃癌细胞株的增殖有明显的抑制作用,且促进其凋亡,能降低其体外迁移能力;下调miR-21后,PTEN活性明显增加;PTEN可能是miR-21参与胃癌发生、发展的靶标之一。

microRNA-24靶向RegⅣ抑制胃癌细胞生长与转移

目的:探讨microRNA-24(miR-24)在胃癌中的作用及其作用靶基因。方法 :采用qRT-PCR的方法检测miR-24在9株胃癌细胞和永生化胃黏膜上皮细胞GES-1中的表达,同时检测63例病人的胃癌组织及相应的癌旁正常组织中miR-24的表达,分析miR-24与胃癌临床病理特征之间的关系。应用miR-24模拟体转染胃癌细胞株,使其过表达miR-24,细胞增殖试验(CCK-8法)、流式细胞技术(Annexin-Ⅴ/PI标记)、Transwell试验检测上调胃癌细胞株miR-24表达后细胞增殖、凋亡、迁移和周期的变化;并用ELISA技术和双荧光素酶基因报告载体检测miR-24是否调控RegⅣ的表达。结果:54.0%(34/63)胃癌病人的miR-24在肿瘤组织中表达,与相应的癌旁正常组织相比下降,且miR-24在肿瘤组织中的表达与胃癌的组织分化程度相关(r=0.292,P=0.021),与其他的临床病例特征如年龄、性别、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期没有相关性。miR-24抑制胃癌细胞的生长与转移,且促进胃癌细胞的凋亡。miR-24可降低RegⅣ的蛋白表达水平。结论:miR-24抑制胃癌的发生、发展,miR-24可能通过调控RegⅣ的表达来发挥其生物学效应。RegⅣ与miR-24均在胃癌的发生、发展中发挥了重要作用。

肌盲样蛋白1在恶性肿瘤中作用的研究进展

肌盲样蛋白1(muscle blind-like protein 1,MBNL1)是一种RNA结合蛋白,其作为前体信使RNA(precursor mRNA,pre-mRNA)的可变剪接因子,在发育过程中起调节作用,有助于对特定转录集的转录后调控。MBNL1可以影响RNA成熟和表达过程的多个步骤,包括pre-mRNA的剪接、降解、RNA输出、稳定性维持、修饰和翻译等。MBNL1最早被认为是强直性肌营养不良发病机制的相关因子,随着研究的深入,其在多种非肿瘤性疾病以及肿瘤性疾病中的作用逐渐凸显。研究表明,MBNL1在多种疾病中表达异常,并且与恶性肿瘤如胃癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、脑胶质瘤、肺癌、血液系统肿瘤等的发生、发展以及转移密切相关。由于细胞种类和发育环境的不同,正常细胞和肿瘤细胞中MBNL1蛋白水平的变化具有多样性。MBNL1既可作为转录激活因子促进肿瘤的发生与发展,也可作为转录阻遏因子抑制肿瘤的生长、转移等过程,在恶性肿瘤的发病过程中发挥重要作用。该文就MBNL1在肿瘤发生发展中的分子机制、生物学特性及其在不同恶性肿瘤中的表达和功能进行综述,为肿瘤的靶向治疗及预后评估提供新的研究思路。

光滑假丝酵母PDR1基因敲除菌株的建立

目的:构建光滑假丝酵母ATCC2001菌株PDR1基因敲除突变株。方法:用PRODIGE同源重组技术,以pY24GAL10为模板,设计80 bp长引物合成PDR1-URA3基因敲除组件,并将其转化入URA3已发生突变的ATCC2001/ura3菌株,经SD-URA选择性平板筛选后获得稳定敲除PDR1的ATCC2001/ura3 pdr1Δ菌株。结果:成功构建光滑假丝酵母PDR1基因敲除菌株ATCC2001/ura3 pdr1Δ。结论:此法可用于精确敲除光滑假丝酵母目标基因。ATCC2001/ura3 pdr1Δ菌株的构建将为进一步研究该基因在光滑假丝酵母中的功能及其作用机制奠定基础。

结直肠癌γ-synuclein基因启动子CpG岛的去甲基化及其临床意义

目的 探讨结直肠癌中γ-synuclein基因的表达与启动子区CpG岛甲基化修饰之间的关系,以及γ-synuclein基因去甲基化水平与结直肠癌临床病理特征的关系.方法 采用半定量RT-PCR法检测30例结直肠癌和相应癌旁组织中γ-synuclein基因的表达及去甲基化试剂5-杂氮-2＇-脱氧胞苷（5-Aza-C）干预对结直肠癌细胞COLO205、LoVo和SW480的γ-synuclein基因表达的影响.采用亚硫酸氢盐修饰测序（BSP）法检测5-Aza-C处理前后CpG岛的甲基化情况.采用巢式甲基化PCR（NMSP）及实时荧光定量MSP法检测67例结直肠癌组织和30例相应癌旁组织中γ-synuclein基因的甲基化状态,并分析其与临床病理特征的关系.结果结直肠癌组织中γ-synuclein mRNA的表达水平0.66±0.34,高于相应癌旁组织的0.45±0.26,差异有统计学意义（P=0.011）.5-Aza-C处理后,COLO205、LoVo和SW480细胞γ-synuclein mRNA表达水平明显上升,同时γ-synuclein基因启动子区CpG岛的甲基化水平明显降低.80.0%（24/30）的结直肠癌组织和50.0%（15/30）的相应癌旁组织的γ-synuclein基因被去甲基化,结直肠癌组织中γ-synuclein基因去甲基化的趋势明显强于相应癌旁组织（P=0.030）.γ-synuclein基因的去甲基化水平与结直肠癌的淋巴结转移、临床病理分期及远处转移有关.结论 结直肠癌中γ-synuclein基因的上调表达与启动子区CpG岛的去甲基化状态有一定关联,γ-synuclein基因的去甲基化水平有望成为结直肠癌患者判断预后的潜在标志物.

比较重复序列PCR与多位点序列分型技术用于光滑假丝酵母菌的基因分型检测

目的评价REP-PCR基因分型技术在临床光滑假丝酵母菌株分型中的应用价值。方法收集2009-2010年上海瑞金医院、上海仁济医院、上海华山医院、安徽医科大学附属医院、深圳人民医院38株光滑假丝酵母菌。采用MLST法扩增光滑假丝酵母菌的6个管家基因内片段，扩增片段测序后与数据库数据比对得出等位基因谱，从而得到相应的序列型（sequence type，ST）。采用REP-PCR法设计Ca21、Ca22、Corn21引物扩增38株光滑假丝酵母菌重复序列，通过电泳比较分析，获得REP．PCR型。比较两种分型方法的结果和效率。结果以Ca22．Com21为引物的REP-PCR分型效果最好。REP-PCR和MIST分型结果相同，38株光滑假丝酵母菌共产生5种REP-PCR型，分别为A、B、C、D、E型，对应于MIST的S17、ST3、ST19、ST45和新型。REP-PCR比MIST耗时短。结论REP-PCR方法简单快速，且分辨率与MLST技术相同，可作为实验室大量菌株分型的首选方法。