重组阴道毛滴虫黏附蛋白33单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备重组阴道毛滴虫(T.υ)黏附蛋白33(AP33)单克隆抗体(McAb)并进行初步鉴定。方法将pET32(a)-AP33重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),用0.5 mmol/L IPTG诱导表达,超声破菌后获得可溶性表达产物,通过Ni-NTA法纯化,以纯化的融合蛋白33为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,用ELISA和有限稀释法筛选出分泌高滴度McAb杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,免疫印迹分析其特异性。结果共筛选出能稳定分泌抗AP33单克隆抗体的5株(4A2,4F11,4F8,4E7,4H11)杂交瘤细胞株,抗体重链均为IgG1;腹水的上清效价为1∶40 000-1∶80 000。免疫印迹分析显示,5株单抗均能与重组阴道毛滴虫AP33发生特异性结合;与阴道毛滴虫抗原分子量为33kDa抗原分子结合。结论制备的抗重组AP33杂交瘤细胞株能分泌识别重组AP33的高特异性单抗,为进一步研究其在阴道毛滴虫病免疫诊断中的应用奠定了基础。

不同静脉采血方法导致溶血的比较及护理对策

目的 比较三种不同静脉采血方法溶血的发生率,找出一种最佳采血方法.方法将2012年1～3月间我院急诊科240例患者随机分为三组,各80例.分别使用10 mL注射器、带延长管的一次性真空采血器和BD真空采血器进行采血,血液标本采集后立即摇匀并送检验科进行检测,血液标本采集过程严格按照护理操作规程进行.结果 10 mL注射器采血法、带延长管的一次性真空采血器采血法和BD真空采血器采血法的溶血率分别为8.75%、6.25%、1.25%.与10mL注射器采血法相比,BD真空采血器采血法的溶血发生率显著降低 （P〈0.05）,差异有统计学意义.结论使用BD真空采血器进行采血,血液样本发生溶血率低,临床尽量使用该方法进行采血,以增加血液样本的合格率,降低患者的痛苦.同时,护理人员应规范操作,降低溶血的发生率.

快速诊断滴虫性阴道炎免疫层析试纸条的初步研制

目的用胶体金标记抗阴道毛滴虫重组AP33单克隆抗体制备金标AP33 mAb,研制开发出一种能快速、简便、有效检测阴道毛滴虫感染的免疫层析(GICA)试纸条。方法采用柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒,标记抗阴道毛滴虫重组AP33单克隆抗体,选择最佳反应模式组装试纸条。用该试纸条检测滴虫性阴道炎患者及非滴虫性阴道炎患者白带中的靶抗原,鉴定方法的敏感性和特异性。结果用制备的免疫层析试纸条检测重组AP33抗原的最低量为20 ng/ml,其中以单克隆抗体4A2为包被抗体、单克隆抗体4F8为金标抗体的试纸条检测效果最佳。以湿片法为标准,用该试纸条检测60例滴虫性阴道炎患者白带,敏感性为90.0%(54/60);检测60例非滴虫性阴道炎患者白带,特异性为95.0%(57/60)。两法的总符合率为92.5%。结论GICA检测阴道毛滴虫特异性强、灵敏度高、简便快速,无需特殊仪器设备,有广泛应用价值。

库存血告急时手术患者输血方案探讨

目的探讨库存血告急时手术患者的输血方案。方法术前制定不同的输血方案,将手术患者分为4组:第1组为择期手术,术中出血可能性小,放弃常规备血,只备血浆;第2组为择期手术,术中出血可能性大,符合自身输血标准,对患者进行贮存式自体输血;第3组为择期手术,但不符合自身输血标准,控制手术用血指征,出血严重者,补充血浆和借用部分急诊用血;第4组为急诊手术,启用告急库存中的应急用血部分。结果第1组30例仅有1例输血浆350mL;第2组22例中有19例未输异体血,其中2例术中仅输血浆400mL;第3组在控制手术输血指征后,10例有3例占用急诊用血库中的红细胞共6U;第4组5例急诊手术启用急诊用血和手术视野失血回收结合输血,所有手术均顺利实施,未造成血液浪费、耽误临床用血及患者手术延迟。结论控制输血指征、发挥自体输血和血浆与急诊用血综合性血液结合的输血方案可保证血库库存血告急期间继续保持各科手术的顺利进行。

患者A_1抗原检测分析

目的调查分析本院A抗原凝集强度正常且ABO正反定型结果相符的A型与AB型住院患者红细胞表面A1抗原的表达情况。方法采用常规试管法分别对A抗原凝集强度正常且ABO正反定型结果相符的3 020例次A型和780例次AB型住院患者红细胞进行A1抗原筛检,筛检结果阴性的标本采用4℃吸收-56℃放散试验进行A1抗原确认。结果 A型患者与AB型患者初筛试验的A1抗原阳性率分别为99.2%(2 995/3 020)、95.6%(746/780),组间比较差异有统计学意义;初筛AB型患者A1抗原表达强度明显弱于A型患者,组间比较差异有统计学意义;初筛阴性标本4℃吸收-56℃放散试验的A1抗原总阳性率为76.3%(45/59),其中A型和AB型患者确认试验的A1抗原阳性率分别为88.0%(22/25)、67.6%(23/34),组间比较差异无统计学意义;综合初筛试验与确认试验结果,A型、AB型住院患者A亚型(或A亚型B)比例分别为0.1%(3/3 020)、1.4%(11/760),组间比较差异有统计学意义(χ2=30.1)。结论 A抗原凝集强度正常且ABO正反定型结果相符并不能完全排除A亚型(或A亚型B),临床有无必要对A型和AB型患者常规开展A1抗原检测值得进一步探讨。

无精症患者的细胞遗传学分析——附2例首报异常核型

目的:探讨无精子症患者的染色体畸变类型。方法:对72例无精子症患者进行染色体核型分析。结果:检出染色体异常核型16例,占22.22%。16例中,性染色体异常13例,占81.25%,常染色体异常3例,占18.75%。性染色体异常中,Klinefelter综合征8例,占61.54%。Y染色体结构、形态异常各1例(46,XY,del(Y)(q11)、46,XY,Yqh+),占15.38%。性反转3例,占23.08%,其中2例社会性别为男性,核型为46,XX;1例社会性别为女性,核型为46,XY。常染色体异常中,22pstk+1例,平衡易位2例(皆为首报异常核型,分别为46,XY,t(6;22)(p23;q11)、46,XY,t(5;14;11)(q15;p11;q23))。结论:无精子症患者进行细胞遗传学分析,对其诊断和治疗具有重要意义。

具有miRNA海绵功能的circRNA的生物信息学分析与鉴定

目的对一种新的具有miRNA海绵功能的circRNA_hsa_circ_0000254结构、功能进行生物信息学分析与鉴定。方法采用生物信息学对hsa_circ_0000254的二级结构及靶向序列进行分析，通过双荧光素酶实验验证hsa_circ_0000254与靶基因的结合情况。结果生物信息学分析发现hsa_circ_0000254，剪接序列长度为524nt，包含11个miR_125b可结合位点；双荧光素酶实验证实hsLcirc_0000254与miR_125b具有较高的结合效率。，结论hsa_circ_0000254能以miRNA海绵形式抑制miR-125b，有可能作为靶向治疗工具应用于高表达miR－125b的白血病治疗。

抗阴道毛滴虫AP33单克隆抗体的制备及其功能初探

目的制备阴道毛滴虫(T.υ317株)黏附蛋白抗原(AP33)单克隆抗体并初步分析鉴定其功能。方法将制备和纯化的融合黏附蛋白33(rAP33)为抗原,免疫BALB／c小鼠,共免疫3次(抗原含量分别为100、50和100μg),每次间隔2周,末次免疫后3 d取小鼠脾细胞及SP2／0骨髓瘤细胞在聚乙二醇(PEG1500)作用下进行细胞融合,筛选出高滴度分泌的McAb杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,蛋白质印迹(Western blotting)分析其特异性,间接免疫荧光实验(IFAT)进行定位,并初步探讨其体外对阴道毛滴虫黏附HeLa细胞的抑制作用。结果经筛选获得能稳定分泌抗AP33单克隆抗体的5株(4A2,4F11,4F8,4E7和4H11)杂交瘤细胞株,经免疫球蛋白类型和亚型鉴定为IgG1; ELISA和Western blotting分析显示,5株单抗均能与重组阴道毛滴虫AP33发生特异性结合;IFAT显示其中4株(4F11, 4F8,4E7,4H11)可识别培养的阴道毛滴虫,体外滴虫黏附抑制实验显示终浓度分别为200、200、400和200μg/ml,该4株单抗体外对滴虫黏附HeLa细胞的抑制率分别为50．08％,65．03％、50．70％和49．08％。结论制备的抗重组AP33单克隆抗体,体外对阴道毛滴虫黏附有较好的抑制功能。

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征并发2型糖尿病患者线粒体DNA16189T→C变异情况调查

目的调查阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（OSAHS）并发2型糖尿病（T2DM）患者中线粒体DNA（mtDNA）16189T→C变异情况。方法采用聚合酶链反应结合限制性内切酶酶切（RELP-PCR）对134例OSAHS患者线粒体DNA（mtDNA）16189T→C变异进行分析，其中OSAHS并发T2DM患者52例，单纯OSAHS患者82例，同时以122例T2DM非OSAHS患者作为对照组，并以113例健康体检人群为空白组进行基因分布频率筛查。结果OSAHS并发T2DM组中mtDNA16189T→C突变的发生率（55．8％）显著高于单纯0SAHS组，差异具有统计学意义（29．2％，P〈0．001），与T2DM非OSAHS患者比较差异也有统计学意义（36．1％，P=0．016）；OSAHS并发T2DM组中，mtDNA16189T→C突变型胰岛素抵抗指数（IR）与野生型比较差异具有统计学意义（P=0．0001）。结论OSAHS并发T2DM患者存在较高的16189T→C突变，且此突变可能与IR相关。

机采血小板储存过程中5种miRNA前体的表达变化

目的分析机采血小板储存过程中表达量有明显升高的5个miRNA前体(pre-miRNA)表达谱,为研究机采血小板中miRNA的成熟及调节机制提供参考。方法分别提取不同储存时间(1、3、5 d)各2 m L机采血小板总RNA,以5S rRNA为内参照,采用实时荧光定量(qRT-PCR)法分别检测5个miRNA前体pre-miR-16、-96、-150、-155和-316的表达水平。结果以新鲜机采血小板0 d pre-miRNA表达水平为基准,pre-miR-16的相对表达量在1、3、5 d分别为0.98±0.08、0.96±0.11、0.92±0.14;pre-miR-96的相对表达量在1、3、5 d分别为0.97±0.08、0.98±0.09、0.94±0.12;pre-miR-150的相对表达量在1、3、5 d分别为0.95±0.09、0.91±0.06、0.93±0.15;pre-miR-155的相对表达量在1、3、5 d分别为0.97±0.12、0.95±0.08、0.95±0.10;pre-miR-326的相对表达量在1、3、5 d分别为0.98±0.08、0.96±0.12、0.86±0.18。相对于新鲜血小板,上述5种pre-miRNA在储存过程中表达量无明显改变(P>0.05)。结论机采血小板储存过程中表达量明显升高的5个miRNA的pre-miRNA表达相对稳定,并未伴随miRNA表达改变而改变。

一例弱D血型表型及基因型鉴定分析

目的:分析中国汉族人群中发现的一例弱D血型表型及基因型。方法:分别采用盐水法及微柱凝集(玻璃珠/凝胶)卡对该弱D血型进行血清学分析,鉴定该标本12种D抗原表位以确定其表型,对Rh D基因10个外显子及其侧翼序列进行测序并分析其杂合性。结果:该个体盐水法与微柱凝胶卡法检测均为d Ccee,但微柱玻璃珠卡法抗-D检测结果为1+,D抗原表位分析显示缺失部分D表位。测序检测发现,该标本存在等位基因c. 1022T>A,结合其血清学反应格局更符合部分D表型,RHD合子型鉴定为D/d。结论:中国汉族人群中发现的一例弱D血型归为弱部分D型更为恰当。

DAT阳性的DEL血型鉴定及其家系分析

目的:对1例DEL血型合并直接抗人球蛋白试验阳性患者进行血型鉴定并分析其遗传规律。方法:采用常规血清学试剂对先证者及其家系成员RhD血型进行血清学分析,使用PCR-SSP方法对RHD基因10个外显子及侧翼序列进行扩增、测序并分析其杂合性。对先证者家系进行调查并分析DEL血型遗传规律。结果:先证者DAT强阳性,RHD基因9外显子存在1227G>A等位基因(RHD*DEL1),其母亲为RHD*DEL1携带者。RHD合子型鉴定为RHD+/RHD-,提示该个体单倍型为CD1227Ae/Cde。结论:先证者为DEL型(RHD*DEL1)。

急性髓系白血病(AML)中hsa_circ_0000254的实验研究

目的:通过克隆环状RNA hsa_circ_0000254,构建过表达载体并初步鉴定其表达水平,为进一步的功能研究奠定基础。方法:人工合成hsa_circ_0000254的524 bp序列,用pGH克隆载体合成基因,然后酶切目的片段,连接到慢病毒过表达载体pLCDH-ciR中,测序验证。筛选阳性克隆,分别以pLCDH-circ254(C254)、NC(pLCDH-ciR)转染293T细胞,培养40 h后收集细胞进行PCR检测及产物测序验证。结果:pLCDH-circ254表达载体经测序验证,测序峰图正常,且无杂峰或叠带,序列对比吻合,表明hsa_circ_0000254成功插入环状RNA表达载体pLCDHciR,过表达载体构建成功,表达效率高达1万倍。结论:成功构建hsa_circ_0000254表达载体,可高效表达hsa_circ_0000254。

长途运输对机采血小板凋亡的影响

目的探讨长途运输对机采血小板凋亡的影响。方法将机采血小板分为运输组和对照组,其中运输组需进行约8 h公路长途运输,分别于d1(运输前),d2(运输后),d3,d5取样检测血小板JC-1、Annexin-V等指标。结果运输后随着储存时间延长,运输组和对照组均表现为凋亡水平的逐渐增高。2组之间比较,d1,d2、d3、d5几个时间点,凋亡指标JC-1和AnnexinⅤ在2组之间均有差异(P<0.05)。结论血小板长途运输对血小板的凋亡有明显的影响。

线粒体hsa-let-7b在机采血小板储存过程中的表达变化

目的通过检测机采血小板储存过程中线粒体hsa-let-7b的表达情况,探讨其对血小板凋亡可能的影响。方法提取不同储存时期机采血小板线粒体总RNA及miRNA,以5s RNA为内参照,利用实时荧光定量PCR(qRTPCR)分别检测hsa-let-7b及Bcl-x L mRNA的表达量变化并分析它们的相关性。结果在血小板贮存过程中线粒体hsa-let-7b表达水平明显增加,Bcl-x L mRNA在血小板贮存过程中呈下降趋势,2者之间的表达变化呈负相关,具有显著性(P<0.05)。生物信息学分析推测let-7b可能靶向调控Bcl-x L。结论血小板线粒体hsa-let-7b的表达变化可能是下调Bcl-x L从而促进血小板凋亡的分子机制之一。

嗜人按蚊中肠单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备并鉴定抗嗜人按蚊中肠单克隆抗体杂交瘤细胞株。方法用嗜人按蚊中肠做抗原,用细胞融合技术制备单克隆抗体,并采用ELISA法对单克隆抗体进行筛选和鉴定。结果建立了1株持续分泌抗嗜人按蚊中肠单克隆抗体的杂交瘤细胞株。BALB/c小鼠腹水单克隆抗体的最高稀释度达1∶12 800;单克隆抗体的重链属IgG1亚类;Western blot证实单抗能与嗜人按蚊中肠抗原特异性结合。结论成功制备了抗嗜人按蚊中肠单克隆抗体。

兔抗阴道毛滴虫重组蛋白AP65多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

目的制备、纯化并鉴定兔抗阴道毛滴虫重组蛋白AP65的多克隆抗体。方法日本大耳兔多次免疫重组蛋白AP65,间接ELISA法检测抗体效价,用饱和硫酸铵法和n protein A sepharose 4FF柱纯化多克隆抗体,Western blot检测免疫反应性。结果第3次加强免疫后,间接ELISA法检测血清效价达到1∶25600,用硫酸铵法纯化多克隆抗体纯度为56%,而后采用亲合层析柱n protein A sepharose 4FF再次纯化,纯度达到80%。Western blot鉴定兔抗重组蛋白AP65多克隆抗体能识别重组蛋白AP65。结论成功制备了高效价、高纯度的抗阴道毛滴虫重组蛋白AP65多克隆抗体。

免疫磁珠吸附红细胞悬液中sHLA-I和sFasL分子后对其他成份的影响

同种异体输血造成受血者免疫功能抑制，大量研究表明，可溶性HLA．1（sHLA-I）类分子和可溶性Fas配体（sFasL）分子是引起输血后免疫抑制的主要原因之一。本文拟通过制备免疫磁珠吸附去除血液中的sHLA-I和sFasL分子以减轻输血后免疫抑制的发生，同时监测红细胞悬液中其它成分的变化。

抗sHLA-Ⅰ免疫磁珠的制备与鉴定

目的制备抗sHLA-Ⅰ免疫磁珠去除红细胞悬液和机采血小板中的sHLA-Ⅰ分子。方法将单克隆抗体W6/32以共价偶联的方式包被制备免疫磁珠,以FITC标记的羊抗鼠二抗标记磁珠,用流式细胞仪鉴定包被效果。取10例红细胞悬液和机采血小板上清和制备好的免疫磁珠孵育后移去磁珠,用ELISA检测吸附前后sHLA-Ⅰ浓度变化评价吸附效果。结果制备的抗sHLA-Ⅰ免疫磁珠包被效率约为75%。对红细胞悬液和机采血小板中sHLA-Ⅰ的吸附效果可达到84%和83%。结论采用单克隆抗体W6/32制备的免疫磁珠能有效去除红细胞悬液和机采血小板中的sHLA-Ⅰ分子,在改善临床输血安全方面有广阔的应用前景。