小熊猫紫色色杆菌PCR检测方法的建立及应用

建立小熊猫紫色色杆菌PCR快速检测方法,根据紫色色杆菌毒力T3SS效应因子OspC家族蛋白的基因编码序列设计特异性引物,通过反应条件优化,引物特异性、灵敏性和重复性试验,建立PCR快速检测方法并应用于小熊猫病料和兽舍环境样品检测。结果表明,该PCR方法能特异性检测小熊猫紫色色杆菌,从小熊猫饲养环境和死亡小熊猫体内分离出其他菌株未扩增出条带;最低可检测出0.98 pg/μL的紫色色杆菌DNA,具有较好的重复性;用该检测方法从饲养环境和小熊猫病料中检测到的结果与传统的分离培养和测序比对的结果一致。所建立的PCR方法在实际应用中可快速高效检测出紫色色杆菌,可用于小熊猫紫色色杆菌病病原的检测。

紫色色杆菌感染小熊猫引起肺炎的临床调查

本文报道了福州大熊猫研究中心小熊猫感染紫色色杆菌引起肺炎的群发病例。7只小熊猫中,出现以呼吸衰竭为主要临床症状的3只小熊猫在发病3 d内全部死亡,病死率100%。死亡的小熊猫解剖病变为气管内有白色泡沫样分泌物,肺有化脓性坏死并严重淤血;胸腔,心包积液且胸水浑浊;肝脏呈弥漫性空泡变性,淤血和散在局灶性坏死。通过流行病学调查,病理解剖观察,细菌分离培养和鉴定及动物回归试验,诊断为紫色色杆菌无色变种感染。根据GenBank数据库提供的紫色色杆菌16S RNA基因序列,设计一对引物(5’GAG CAAACA GGA TTA GAT ACC 3’;5’TTA CGG TTA CCT TGT TAC GAC 3’),获得目的基因片段739 bp,将核苷酸序列测定的结果与GenBank数据库提供的7株紫色色杆菌进行同源性比较。分离的菌株(FJ08A)与CV09株、ES-BV4400株同源性均为98.8%,与AY117554株、EAV2株、AJ871127株、LMG3953株、JS1株同源性分别为98.2%、98.0%、94.9%、93.1%、92.8%。依据调查结果和药物敏感试验,对其余4只未发病的小熊猫采取肌肉注射头孢哌酮钠和口服复方新诺明进行预防性治疗,效果良好,未有新病发生。结果表明:(1)紫色色杆菌是革兰氏阴性菌,致病性强,致死率高,腹腔注射分离的紫色色杆菌菌液导致接种小白鼠在2～3 d内全部死亡。小熊猫感染后,发病迅速,致死率高,应引起重视;(2)紫色色杆菌是一种条件致病菌,外伤感染是主要致病因素。

应用微卫星分型进行小熊猫亲子鉴定(英文)

小熊猫栖息于喜马拉雅与横断山脉,是亚洲濒危物种。中国的小熊猫谱系已登记圈养小熊猫个体968只,现有存活个体355只(2013年),然而,现有谱系中存在部分信息不明确的问题。为此,我们选择19对小熊猫特异性引物对41只圈养小熊猫进行微卫星扩增,并分析其亲缘关系。将获取的亲子鉴定结果,结合种群原始记录信息,利用Pedigraph软件构建福州圈养小熊猫的种群遗传谱系图。结果表明:在母子关系确实的情况下,19个基因座位的联合父权排除概率为0.99999968;利用6个已知双亲的后代检验19个基因座位的可信度,后代与双亲的基因型完全符合孟德尔遗传定律,表明19个基因座位能有效确认小熊猫的亲权关系。应用19个微卫星标记成功地为15个后代找到了生物学父亲。尽管一些雌性个体在繁殖期有多重交配的行为,亲子鉴定的结果显示同一窝小熊猫均来自单一父权。基因型比对结果表明7对双胞胎均属于异卵双生子。福州种群的后代中除#920和#921外,其余均源于#487或#898两只雄性,表明不同个体参与繁殖的机会不均等。因此,利用现代繁殖技术,加强濒危野动物种群管理,科学制定繁殖计划具有积极的现实意义。

小熊猫卵巢肥大细胞与雌性生殖干细胞的初步观察

为了解小熊猫卵巢肥大细胞分布情况,收集15只成体小熊猫的卵巢,按常规组织学技术制作组织切片。根据甲苯胺蓝染色结果,肥大细胞主要分布于血管壁与卵泡动脉外膜的结缔组织中,其数量随着发情周期呈规律性变化,发情期最高,乏情期次之,妊娠期数量最少,不同时期之间肥大细胞数量差异极显著(P<0.01);阿尔新蓝-番红花红(AB-S)染色将肥大细胞可分为黏膜型、结缔组织型与混合型。肥大细胞可能对小熊猫的受精,胚胎着床,妊娠有调节作用。免疫组化染色显示,小熊猫卵巢有组胺阳性细胞,这些细胞分布也是随着发情周期呈规律性变化,卵母细胞和生殖上皮细胞呈现小鼠脉管同系物(MVH)阳性反应,说明小熊猫卵巢内存在生殖干细胞。

色杆菌灭活疫苗的制备与免疫效果评价

为防控小熊猫色杆菌病,按细菌灭活疫苗制备程序将海峡(福州)大熊猫研究交流中心2008年、2020年分离的2株色杆菌CV08毒株和CV20毒株经条件优化后灭活,分别制备成灭活菌液与铝胶佐剂联用制备成灭活疫苗。以BALB/c小鼠为试验动物,建立色杆菌感染模型,用2种方式接种CV20毒株灭活疫苗,比较2种接种途径效果。进一步设计2株色杆菌半数致死量(LD_(50))梯度对二免后小鼠进行攻毒保护试验,同时进行交叉攻毒保护试验。结果表明:CV20毒株灭活疫苗肌肉注射效果优于皮下注射。CV08毒株和CV20毒株对每只小鼠的LD_(50)分别为3.2×108、5×10^(7)CFU。色杆菌CV08毒株灭活疫苗对不同LD 50攻毒小鼠的保护率为83%、70%、60%;色杆菌CV20毒株灭活疫苗对不同LD_(50)攻毒小鼠的保护率为75%、70%、10%。试验制备的CV08、CV20毒株疫苗含菌量均为4×10^(9)CFU·mL^(-1),安全检验合格,能对自身菌株感染产生较好的保护效果但无交叉保护效果。

小熊猫繁殖周期血清雌二醇和孕酮含量变化

为研究小熊猫繁殖周期血清雌二醇、孕酮含量变化规律,采用化学发光免疫分析法连续16次测定了2只成体雌性小熊猫血清雌二醇和孕酮含量变化,历经发情间期、发情期和两次妊娠期;连续9次测定了7只小熊猫妊娠期的孕酮含量变化。结果:(1)发情间期,小熊猫血清雌二醇的水平一直维持在低水平(基础水平),进入发情前期,血清雌二醇水平明显升高,在发情期一直维持高水平,配种后迅速降至基础水平;(2)小熊猫血清孕酮含量在发情间期和发情期均维持在较低水平,直至发情期过后才出现升高,在妊娠期一直维持高水平,峰值出现在5月;(3)发情的小熊猫不论妊娠与否,在妊娠期内血清孕酮含量均维持在高水平。研究表明:小熊猫血清雌二醇、孕酮含量变化能直接反映其繁殖规律,雌二醇对启动雌性小熊猫季节性繁殖起重要作用;在妊娠期内小熊猫血清孕酮含量升高不能作为判断小熊猫妊娠的标准;雌性小熊猫在妊娠期有假孕现象。

大熊猫铜绿假单胞菌呼吸道感染继发白色念珠菌性肠炎的诊治

报道了1只大熊猫呼吸道感染,继发肠炎的病例。介绍了其病史,血液学变化和临床症状。经过微生物培养和鉴定,确诊呼吸道感染的致病菌为铜绿假单胞菌,继发性肠炎的致病菌为白色念珠菌。根据药物敏感试验结果,选用阿奇霉素和环丙沙星治愈呼吸道感染;选用氟康唑和金双歧,治愈继发性肠炎。并讨论了铜绿假单胞菌和白色念珠菌的发病原因,总结了临床用药的经验。

日粮中霉菌毒素引发小熊猫中毒性肝炎的临床调查

本文报道了小熊猫霉菌毒素中毒性肝炎的群发病案。35只小熊猫中,21只发病,5只死亡。通过日粮成分调查,饲料中霉菌毒素检测,病原微生物检查,血液参数测定,病理学检查和动物试验,确诊为呕吐毒素(DON)和玉米赤霉烯酮(F-2)毒素中毒。依据调查结果对小熊猫进行治疗,小熊猫预后良好。结论:(1)小熊猫对霉菌毒素(DON和F-2毒素)极其敏感,应予以高度重视;(2)DON和F-2毒素存在相互增强作用,对小熊猫的毒性作用主要为肝毒性和肾毒性,并可导致小熊猫机体免疫功能降低;(3)小熊猫对霉菌毒素的耐受性与环境的适应性有关,应激因素能提高小熊猫对霉菌毒素的敏感性。

福州地区圈养小熊猫的饲养与繁殖

福州大熊猫研究中心于1994年引进小熊猫进行人工饲养。2000年小熊猫繁殖成功。2000～2005年累计饲养成年雌性小熊猫54只，其中33只小熊猫出现发情行为，发情率61％。发情的小熊猫中19只怀孕和分娩，受胎率为57．6％，共产仔36只，幼子育成9只，育成率25％。本文报道了这期间小熊猫的饲养管理和繁殖情况，并讨论了两者间的关系。

雌性小熊猫血清类固醇激素水平的变化

在5只雌性成体小熊猫发情期和妊娠期内(2005年12月至2006年7月),连续23次采集血清,用放射免疫分析法测定小熊猫繁殖周期血清雌二醇(E2)和孕酮(P)含量的变化.结果表明:(1)雌性小熊猫进入发情期,血清E2含量迅速升高,并多次出现峰值,仅有一个峰值与交配行为一致,发情周期14-48 d,平均(28.26±13.24)d(n=5);在怀孕小熊猫的妊娠期内和未孕小熊猫的黄体期内都出现血清E2峰值.(2)血清P含量的升高出现在怀孕小熊猫的妊娠期和未孕小熊猫的黄体期,P含量在配种后开始升高.可见:(1)小熊猫在发情季节出现多次发情;(2)在妊娠期和黄体期可能仍有卵泡发育;(3)根据血清P含量的变化趋势,未发现福州地区圈养小熊猫胚胎延迟着床的证据.

一例紫色色杆菌感染小熊猫的诊治报告

自2020年7月9日以来,福州大熊猫研究中心发现饲养的20只小熊猫群体中,陆续有6只出现精神萎顿、食欲减退或废绝、部分卧地不起、体温升高、呼吸困难及死亡等为主要临床特征的疫病。根据发病情况、临床症状、病理变化及实验室检测,确诊为紫色色杆菌感染。根据药敏试验结果,采取相应紧急防控措施,疫情最终获得有效控制。

奇异变形杆菌引发小熊猫急性腹泻性疾病

本文报道了一起小熊猫以腹泻为主要临床症状的疾病暴发流行,发病27只,发病率90%,死亡2只,死亡率7%。流行病学调查表明,发病的原因与新鲜牛奶污染变质和高温、高湿的环境有关。微生物检验和鉴定结果表明,致病微生物为奇异变形杆菌。注射头孢唑啉钠,同时口服诺氟沙星,疫情得到有效控制。这一事件揭示:野生动物的饲养由于环境的高度限制,极易造成食物中毒,应引起高度重视。

成体雌性小熊猫卵巢组织学观察

2000年至2009年,12只固定于10%福尔马林中非生殖系统疾病死亡的小熊猫卵巢组织,按常规组织学技术制作组织切片,HE染色,光学显微镜观察。结果:(1)不同发情时期卵巢均有原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡分布。发情期的卵巢未观察到典型的成熟卵泡和卵母细胞;(2)原始卵泡数量较少,初级卵泡数量较多,多数初级卵泡和大多数的次级卵泡都处在闭锁状态;(3)卵泡腔出现之前,卵母细胞的直径和卵泡直径同时增长;卵泡腔出现之后,卵母细胞直径增长较慢,卵泡直径增长较快;(4)不同发情时期的小熊猫卵巢均存在大量的间质腺细胞;(5)妊娠小熊猫和发情间期无妊娠小熊猫的卵巢均有发育正常的黄体;(6)卵泡细胞发育呈低柱状至柱状时出现透明带。结论:(1)卵泡闭锁主要发生在初级卵泡阶段,仅少数卵泡能发育至次级卵泡;(2)卵母细胞和卵泡生长呈双相生长的趋势;(3)不同发情时期的小熊猫卵巢间质腺都发达;(4)发情排卵后,非妊娠黄体与妊娠黄体维持的时间相似,证实了小熊猫存在假孕现象。

圈养小熊猫遗传多样性与种群遗传结构分析

小熊猫是亚洲特有的珍稀濒危动物,目前受到栖息地减少、片断化和人类活动干扰等威胁。中国圈养小熊猫已经有60多年历史,约55个机构曾经饲养过小熊猫,现今圈养数量有400多只,评估小熊猫圈养种群的遗传多样性和遗传结构对科学维持圈养种群和保存遗传种质资源意义重大。本研究利用19个微卫星座位,对中国境内11个小熊猫圈养种群的116只个体进行了遗传多样性评估及遗传结构分析。结果显示11个种群都具有较高的遗传多样性,平均基因丰富度3.505±1.033(北京)至4.026±1.219(冕宁),期望杂合度0.631±0.225(黄山)至0.782±0.171(温岭)。其中福州和无锡种群极显著偏离Hardy-Weinberg平衡。整个圈养群体内各个种群遗传分化系数为0.055,呈显著分化,表明11个种群遗传分化水平较高。Bayesian遗传聚类分析将11个种群聚为三个遗传簇,与野生种群的遗传聚类结果一致。结论:小熊猫圈养种群与野生种群相比,同样具有较高的遗传多样性。因此,圈养小熊猫遗传管理的重点不再是引进野生个体充实圈养种群,应制订科学的繁殖计划,避免近交,从而维持圈养种群的遗传多样性。

小熊猫急性肝炎并发急性胰腺炎病例报告

报道了一例小熊猫急性肝炎并发急性胰腺炎的病例,介绍了病史和临床症状。根据连续2次血液生化检验,血清丙氨酸转氨酶(105 U/L,282 U/L)、谷草转氨酶(111 U/L,1 063 U/L)、ɑ-羟丁酸脱氢酶(281 U/L,542 U/L)、淀粉酶(7 330 U/L,8 410 U/L)都明显高于正常值;连续2次腹水淀粉酶检验分别为753 U/L和1 278 U/L。结果小熊猫病情急性恶化,最终治疗无效而死亡。组织病理检查:肝组织出血性坏死、肝细胞变性;胰腺淤血、腺上皮细胞变性坏死。确诊为急性肝炎并发急性胰腺炎。同时对小熊猫急性肝炎和急性胰腺炎病因、诊断及预防进行了讨论和分析。

日粮中霉菌毒素引发小熊猫中毒性肝炎的临床调查

该文报道了小熊猫霉菌毒素中毒性肝炎的群发病案。35只小熊猫中有21只发病、5只死亡。通过日粮成分调查、饲料中霉菌毒素检测、病原微生物检查、血液参数测定、病理学检查和动物试验,确诊为呕吐毒素(DON)和玉米赤霉烯酮(F-2)毒素中毒。依据调查结果对小熊猫进行治疗,小熊猫预后良好。结论:(1)小熊猫对霉菌毒素(DON和F-2毒素)极其敏感,应予以高度重视。(2)DON和F-2毒素存在相互增强作用,对小熊猫的毒性作用主要为肝毒性和肾毒性,并可导致小熊猫机体免疫功能降低。(3)小熊猫对霉菌毒素的耐受性与环境的适应性有关,应激因素能提高小熊猫对霉菌毒素的敏感性。

小熊猫血液生理生化指标的测定

为建立健康成体小熊猫血液生理生化参数指标,选择福州大熊猫研究中心圈养的28只(雌性20只,雄性8只)外观发育正常、临床检查健康的小熊猫作为试验对象,通过食物引诱自行进入夹笼,在无麻醉的情况下,静脉采血。用全自动血细胞分析仪和生化分析仪检测23项血液参数和25项血液生化参数。用SPSS11.5统计软件包对各参数计算平均值(-X)和标准差(SD),t检验比较雄性与雌性小熊猫相应指标的差异显著性。测定结果为小熊猫的疾病诊断、动物检疫和相关的研究提供科学的依据。

小熊猫IL-17的克隆及原核表达

为制备小熊猫白介素17(IL-17)表达产物,提取活化的小熊猫外周血单个核细胞总RNA,合成cDNA,以此为模板克隆IL-17的成熟肽编码序列,将其重组到原核表达载体pET-32a,并将其转入到BL-21(DE3)中,进行序列分析。重组载体经IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化。结果显示,小熊猫IL-17的CDS区由462bp组成,含23个氨基酸组成的信号肽,重组IL-17由130个氨基酸组成。SDS-PAGE显示,原核表达产物在诱导温度25℃,IPTG浓度0.5mmol/L,诱导时间20h的条件下,能够获得最佳表达。

小熊猫中暑的临床诊治

小熊猫（Ailurus fulgens）属食肉目、浣熊科，主要栖息于海拔1400-3600m的喜马拉雅山及横断山脉，是亚洲特产动物。由于栖息地减少和遗传漂变等原因，其濒危程度加剧，被列为濒危野生动植物国际贸易公约（CITES）附录I中，是我国Ⅱ级重点保护野生动物，并严格控制国际间贸易。

圈养小熊猫血液生理及生化指标的检测分析

本文用全自动血细胞分析仪和生化分析仪检测17只小熊猫血液成分。试验总共获得23项血液生理检测数据和24项血液生化检测数据。并将其血液生理及血液生化数据用计算机作统计分析。建立小熊猫血液生理、生化参考指标,供今后在临床和科研中参考。