利用CRISPR-Cas9技术编辑Badh2基因创制优质香型籼稻三系不育系

稻米香味是水稻的重要食味品质之一,其主要受第8染色体上编码甜菜碱脱氢酶基因Badh2控制,该基因突变可导致香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)的含量增加从而促进香味的产生。本研究以三明市农业科学研究院自主选育的优质籼型杂交稻保持系明太B为受体,利用CRISPR-Cas9技术对其Badh2基因进行编辑和敲除。获得2个T0代转基因纯合突变体植株并对其衍生的48个T1代单株进行鉴定和分析,获得1个不含转基因载体骨架且在第2外显子插入单个碱基T的纯合突变体株系明太B-badh2。利用半定量PCR和qRT-PCR技术以及气相色谱质谱联用仪(GC-MS)检测Badh2基因相对表达量和2-AP含量;同时采用农业行业标准(NY/T1433-2014)推荐的48对水稻SSR引物进行指纹图谱分析。结果表明,该株系Badh2基因RNA表达水平显著下调;籽粒中香味物质2-AP的含量显著增加;指纹图谱分析发现,仅1对引物Rm571在野生型和突变体之间鉴定到等位变异,两组材料遗传差异较小。此外,本研究还对野生型和突变体T2代植株表型性状、稻米蒸煮食味品质和外观品质指标进行了考察和测定分析。结果表明,所有指标在两组材料间均无显著差异。进一步采用测交和回交转育方法并结合Badh2位点测序分析,成功选育获得了其对应的纯合香型三系不育系明太A-badh2。通过与恢复系明恢703、明恢3009测配,其组合产量与国家审定品种明太优703、明太优3009相近且表现出较强的超标优势。此外,通过与香型恢复系明恢1831测配后发现其组合籽粒中香味物质2-AP含量极显著高于对照组合明太A/明恢1831。因此,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,可对水稻香味基因Badh2进行精准定向编辑和敲除,实现对水稻香味性状的改良,为创制香型籼稻不育系提供理论指导,从而加快香型杂交稻育种进程。

水稻苗期耐盐性基因SST分子标记的筛选与应用

以水稻耐盐突变体sst为对照,对67个水稻亲本及突变体sst与水稻品种华占的F2群体进行耐盐性筛选,并结合分子标记结果,分析水稻苗期耐盐性基因SST分子标记ID27093、ID27101、ID27118、INDEL1和INDEL2的特异性和准确性.结果表明,分子标记ID27093、ID27101、ID27118和INDEL1的扩增多态性较低;而分子标记INDEL2的扩增多态性较高,为共显性标记,具有较高的特异性,能区分耐盐供体sst与85.07%的供试亲本,且筛选准确率高.因此,分子标记INDEL2标记可以直接用于耐盐性基因SST分子标记辅助育种.

‘泰国小香占’香味基因的鉴定和功能分子标记的开发

香稻育种已成为当前杂交水稻育种的一个重要方向,选择和利用株型好、米质优、抗性强等综合性状优良且具有香味的水稻亲本,尤其是香型水稻恢复系亲本的利用,对进一步促进杂交水稻香稻的选育具有重要意义。‘泰国小香占’是目前国内水稻香稻育种中应用较广且综合性状优良的恢复系亲本,其米质优、抗性强、香味浓。为了探究‘泰国小香占’香味产生的原因,本研究鉴定了‘泰国小香占’的香味基因及其突变类型,发现其香味来源于编码甜菜碱脱氢酶基因Badh2的功能缺失突变,且通过对该基因完整基因组序列扩增和测序分析发现其等位突变类型为badh2-E7类型,即在第7外显子处存在8 bp缺失和3个单核苷酸位点多态性突变(SNPs)。通过气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)测定其籽粒中香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)的含量为0.108 mg/kg,明显高于非香味品种‘日本晴’和‘9311’的含量(<0.01 mg/kg)。实验还证明了特异性分子标记FMbadh2-E7、InDel-E7以及自主开发设计的特异性功能标记FMbadh2-E7A和FMbadh2-E7B均可高效、准确鉴别出非香纯合(Badh2/Badh2)、非香杂合(Badh2/badh2)和香味纯合(badh2/badh2)3种基因型。同时本研究还进一步通过对‘泰国小香占’和非香味水稻品种杂交F2代单株进行了基因型和遗传规律分析,发现其基因型Badh2/Badh2:Badh2/badh2:badh2/badh2的比例为1∶2∶1,符合孟德尔细胞核单基因控制分离比。本研究通过对‘泰国小香占’香味基因的鉴定、遗传特性分析以及特异性功能分子标记的开发和验证,为进一步通过分子标记辅助选择育种技术,应用‘泰国小香占’香味基因培育优质、高产且抗性强的杂交水稻香稻提供了重要的理论基础。