不同鸭疫里默氏杆菌菌株携带生物被膜形成相关基因的分析

为筛选鸭疫里默氏杆菌(RA)生物被膜形成过程中的关键基因,本研究先采用PCR检测了10个生物被膜形成相关基因在生物被膜形成强、弱和无的菌株中的分布,根据试验结果,比较了CH3株在置玻璃试管和12孔聚乙烯板中培养时5个生物被膜形成相关基因在转录水平上的差异。结果表明,21株RA中强、弱和无生物被膜形成的菌株分别占28.57%(6/21)、23.81%(5/21)和47.61%(10/21);这些RA菌株均携带asrpdp(Riean_0487)、dhdps(Riean_0023)、ftsQ(Riean_1039)和hthdp(Riean_0339)4个基因;而大部分生物被膜形成能力弱的菌株和不形成生物被膜的菌株不携带aminopeptidase N(Riean_0186)和hp1(JN986833)基因。Real-time PCR结果表明,CH3株在24孔板中培养至生物被膜形成初期(10 h)比同时在玻璃试管中静置培养时,细菌的aminopeptidase N、hthdp和dhdps基因mRNA转录水平分别升高62.1%、102.3%和62.5%。本研究为进一步解析RA生物被膜形成的分子机制等奠定基础。

鸭疫里默氏杆菌TonB依赖性受体TbdR2基因缺失株的构建

用PCR方法扩增tbdR2基因的左右臂和壮观霉素抗性基因表达盒,然后将以上3个片段组成的同源重组同源臂LSR连接到自杀性质粒pDS132上,构建得到重组自杀质粒pDS-TbdR2-LSR。再将此质粒通过接合转导的方法导入到鸭疫里默氏杆菌CH3株。用含卡那霉素和壮观霉素的TSA筛选可能的基因缺失株,并对其进行PCR鉴定,获得基因缺失株CH3△tbdR2。CH3△tbdR2稳定性检测结果表明该缺失株能够稳定存在。另外,CH3△tbdR2突变株在电镜下的细菌形态以及在TSA培养基上的菌落形态与野生株CH3相似。表明通过自杀质粒同源重组的方法获得了鸭疫里默氏杆菌CH3株TonB依赖受体TbdR2的基因缺失株CH3△tbdR2,为下一步研究TbdR2的功能奠定了基础。

鸭坦布苏病毒分离鉴定及全基因组序列分析

本文采集2015年浙江省2个鸭养殖场中疑似鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)感染的雌麻鸭卵巢病料,经组织研磨处理,DF-1细胞纯化,成功分离了2株鸭坦布苏病毒(DTMUV),分别命名为ZJ201501和ZJ201504。利用9对两两相互重叠的PCR引物,对这2株病毒的全基因进行分段PCR扩增,经序列测定和拼接,得到病毒的全基因组序列。核苷酸序列和E蛋白氨基酸序列比对分析发现:ZJ201501和ZJ201504的核苷酸同源性高达99.9%,全长氨基酸仅有2个位点差异;与选取的19株DTMUV参考序列相比,在核苷酸水平和E蛋白氨基酸水平上,其同源性分别大于97.1%和98.4%,而ZJ201501和ZJ201504与早期分离的DTMUV FX2010遗传距离最远,这表明DTMUV在鸭群中发生了一定的变异。本研究为进一步了解DTMUV的遗传进化提供了理论依据。

副鸡嗜血杆菌的分离与鉴定

[目的]对1例鸡传染性鼻炎疑似病例进行病原菌的分离与鉴定。[方法]从安徽省某鸡场发生的以脸面肿胀、流泪和产蛋下降为临床特征的病鸡上呼吸道分泌物中分离细菌,并进行染色、镜检、菌落形态观察,并利用"卫星现象"和PCR等方法进行鉴定。[结果]成功分离到1株副鸡嗜血杆菌,经鉴定为C型副鸡嗜血杆菌。动物回归试验表明,该分离株能引起典型的鸡传染性鼻炎,对鸡具有较强的致病力。[结论]该研究可为鸡传染性鼻炎的预防与控制提供依据。

应用抑制性差减杂交筛选鸭疫里默氏杆菌强弱菌株基因组的差异片段

为了分析鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)强毒菌株HXb2和弱毒菌株NJ-1基因组之间的差异基因,以HXb2株基因组为待测菌株,以NJ-1株基因组为驱动菌株,构建了两株细菌基因组间的抑制性差减文库。经过dot-blot杂交和PCR验证,共鉴定到34个强弱毒株基因组差异片段。测定的序列经BLAST、DNAStar和PSORTb分析,结果表明有2个片段所在基因编码的蛋白为外膜蛋白,有2个片段所在基因编码的蛋白为胞质膜蛋白如磷酸盐转运蛋白,11个片段所在基因编码的蛋白为胞内蛋白如丙氨酸脱氢酶、β-内酰胺酶及一些假定蛋白等,有19个片段所在基因编码的蛋白(大部分为假定蛋白)定位未知。这些差异基因编码的蛋白可能与鸭疫里默氏杆菌的毒力及HXb2株特异蛋白等有关。本研究为下一步鉴定新的毒力基因及其他特异蛋白的功能奠定了基础。

鸭疫里氏杆菌转座子随机突变库的构建

通过接合转导的方法构建鸭疫里氏杆菌Yb2和CH3株的Tn4351转座子突变库,以便筛选和鉴定鸭疫里氏杆菌的功能基因。先将携带质粒pEP4351(含Tn4351转座子序列)的大肠杆菌BW19851(pEP4351)作为供体,与受体菌鸭疫里氏杆菌强毒株Yb2或CH3株进行接合转导,使质粒pEP4351导入Yb2或CH3株细菌内,进而转座子Tn4351随机插入鸭疫里氏杆菌的基因组中,然后用含红霉素和卡那霉素的胰酶大豆琼脂平板进行阳性接合子的筛选。用PCR扩增鸭疫里氏杆菌16S rRNA基因和红霉素抗性基因EmF进行转座子插入突变株的鉴定,最终成功地构建了鸭疫里氏杆菌Yb2株和CH3株各包含3 100株和2 520株突变株的Tn4351转座子随机突变库,接合转导效率分别为1.7×10-6和3.9×10-6。转座子随机突变库的构建为下一步根据突变株表型的变异来筛选和鉴定鸭疫里氏杆菌的毒力相关等基因奠定了基础。

一株鸭疫里默氏杆菌自然弱毒株的鉴定

从病死鸭肝中分离到1株革兰氏阴性细菌WX1株,经形态学特征观察和16SrRNA基因、DnaB基因检测,鉴定为鸭疫里默氏杆菌;经玻片凝集试验鉴定为血清1型。WX1株对10日龄樱桃谷鸭的半数致死量大于1010 CFU,接种樱桃谷鸭后,只在接种后第12小时能从血液中分离到少量接种菌,表明WX1株为一株自然弱毒株。WX1株的OmpA序列测定及分析结果显示,其氨基酸同源性及其蛋白质分子质量大小与不同血清型的鸭疫里默氏杆菌强毒株存在一定的差异。