猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光定量PCR方法的建立与应用

为了建立能够猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)和非洲猪瘟病毒(African swine fe⁃ver virus,ASFV)双重荧光定量PCR方法,试验比对了CSFV与ASFV的基因组序列,针对CSFV 5′-UTR和ASFV B646L保守靶序列,分别设计2条特异性引物及1条TaqMan探针,通过优化扩增体系和程序,建立可同时检测CSFV和ASFV的双重荧光定量PCR方法,并建立该方法的标准曲线,同时用敏感性试验、特异性试验和重复性试验对该方法进行评价,最后检验该方法的应用效果。结果表明:CSFV和ASFV标准曲线的相关系数(R2)分别为0.999和1,线性关系良好;CSFV与ASFV的最低检测浓度分别为1.3×100 copies/μL和2.4×100 copies/μL;与其他常见猪只病原检测无交叉反应;批间与批内变异系数均小于2%,稳定性良好。试验建立的方法对44份临床样本的检测结果与《猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法》(GB/T 27540—2011)和《非洲猪瘟诊断技术》(GB/T 18648—2020)检测结果一致。说明试验建立的双重荧光定量PCR方法敏感、特异、稳定,可用于CSFV和ASFV的快速检测和鉴别诊断。

PRRSV经典毒株、高致病毒株、类NADC30毒株及类NADC34毒株鉴别RT-PCR检测方法的建立及应用

为提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)不同流行毒株的快速鉴别诊断能力,本研究对近几年国内外流行的PRRSV不同毒株的Nsp2核苷酸序列进行比对,设计了1对可用于鉴别4类不同PRRSV毒株的简并引物,建立了鉴别PRRSV经典毒株(C-PRRSV)、高致病毒株(HP-PRRSV)、类NADC30毒株(NADC30-like)及类NADC34毒株(NADC34-like)的RT-PCR检测方法。结果显示,C-PRRSV、HP-PRRSV、NADC30-like、NADC34-like毒株Nsp2基因的扩增片段大小分别为1072 bp、982 bp、679 bp、772 bp,检测限分别为4.70×10 copies/μL、3.34×10^(2)copies/μL、8.57×10 copies/μL、5.71×10^(2)copies/μL,对其他常见猪病病原均未扩增出特异性条带,3次重复试验均能够扩增出均匀一致的目的片段;83份临床组织样品共检出阳性27份,其中NADC30-like毒株7份、NADC34-like毒株20份,与GP5基因检测结果的符合率为97.6%。上述结果表明,本研究建立的PRRSV鉴别RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于C-PRRSV、HP-PRRSV、NADC30-like、NADC34-like毒株的快速鉴别和流行病学调查。