鸭坦布苏病毒分离鉴定及其囊膜蛋白遗传进化分析

【目的】了解并掌握鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)流行特点及病毒生物学特性,为DTMUV防治提供理论依据和技术支撑。【方法】通过细胞及鸡胚接毒试验对河北某鸭场10只具有典型临床症状的发病鸭进行病毒分离,用RT-PCR、透射电镜观察、Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)等方法鉴定,进行动物回归试验测定病毒毒力并对其进行囊膜蛋白遗传进化分析。【结果】分离到的病毒可在DF-1细胞上稳定增殖产生典型细胞病变效应(CPE)并致死鸡胚;病毒纯化后经电镜观察可见直径30~60 nm的病毒粒子;RT-PCR结果显示,在约270 bp处可见单一条带,与DTMUV预期大小一致;Western blotting结果显示,在60 ku处有特异性条带,与E蛋白大小一致;IFA结果表明,接种病毒的DF-1细胞胞质中可见明亮的特异性荧光,以上结果均表明分离的病毒为DTMUV。将分离到的病毒命名为AX2020株,AX2020株经肌内注射感染北京鸭后感染率高达100%,发病鸭产生神经症状及腹泻等典型临床症状;经序列比对发现AX2020株和GA株(MK907880.1)相似性最高,与SD14毒株(MH748542.1)亲缘关系较远。与商品灭活疫苗毒株HB2010株(MN649262.1)和活疫苗毒株FX2010株(MH414568.1)相比,AX2020株第93、277和487位氨基酸发生了的突变。【结论】成功分离得到1株DTMUV AX2020株,分离毒株对北京鸭具有较强的致病性,AX2020株的囊膜蛋白与国内疫苗毒株相比,已经发生了氨基酸位点的突变,结果为鸭坦布苏病毒病的流行病学及后续疫苗相关研究奠定了一定的基础。

三种鸽源病毒多重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种可以快速检测鸽疱疹病毒(Pi HV)、鸽圆环病毒(PiCV)和鸽源腺病毒(PiADV)的三重PCR方法,本研究针对3种病原的保守区域分别设计合成了3对特异性扩增引物,在优化反应体系、反应条件的基础上,分别对其特异性、敏感性和重复性进行验证,建立了能够快速检测以上3种病原的多重PCR方法,并对121份临床样品进行了检测。通过反应条件优化,确定PiHV、PiCV、PiADV引物体积比为1∶1∶2,退火温度为58℃时,扩增效果最好。敏感性试验显示,PiHV、PiCV和PiADV的最低检出量均为1.0×101copies/μL。特异性试验显示,建立的多重PCR方法与鸽新城疫病毒(NDV)、鸽痘病毒(PPV)、鸽轮状病毒(PiRV)没有特异性反应。利用本研究建立的多重PCR方法对121份临床样品进行检测,结果与单重PCR结果一致。综上所述,本研究建立的方法可用于鸽养殖场或公棚的PiHV、PiCV、PiADV快速检测。

经分子佐剂诱导产生的卵黄抗体对NDRV的预防和治疗效力评价

为了预防和应对新型鸭呼肠孤病毒引起的综合疾病,本研究利用分离到的新型鸭呼肠孤病毒,制备了具有良好中和活性的高效价IgY。中和试验结果显示:三免后第14天抗体滴度达到峰值,而后趋于平稳(>26),且添加CpG和IL-2分子佐剂的组别提取的IgY比未添加分子佐剂的组别中和滴度提高约3倍;将抗体注入SPF鸡胚进行攻毒保护试验,结果显示中和组的保护率最高,预防组的略高于治疗组的,且CpG组所提取的IgY预防效果(83%)和治疗效果(75%)最佳。本研究提取的高效价IgY能应用到临床防控中,可有效预防及治疗新型鸭呼肠孤病毒病。

基于重构NDRV σC 蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立

旨在建立灵敏快速诊断新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)抗体的间接ELISA(indirect ELISA,iELISA)方法,为水禽养殖业提供科学有效的检测手段。先前报道σC蛋白为沉淀表达,因此本研究利用大肠杆菌的密码子偏嗜性等规律优化其基因序列进行原核表达,纯化出高纯度的可溶性σC蛋白。采用方阵滴定法确定σC蛋白包被浓度和样品稀释度,初步建立NDRV的iELISA检测方法。分别对84份阳性和180份阴性质控血清进行分析,构建受试者工作特征曲线(ROC),通过Youden指数选择灵敏性和特异性最佳的P值作为阴阳临界值。使用质控阴、阳血清评价试剂盒的批内和批间重复性。用本研究的和实验室先前建立的全病毒包被的iELISA方法同时对质控血清进行检测,比较其符合率。通过方阵滴定法确定各组分条件为σC蛋白包被质量浓度0.5μg/孔、血清稀释度1∶320。构建的ROC曲线下面积为1.00,最佳阴阳临界值为0.076,在此临界值上的灵敏性和特异性均为100%。全病毒包被板和σC蛋白包被板符合率为100%,但前者检测样品的D_(450)值偏低,σC蛋白包被板则弥补了这一缺点。本研究为NDRV提供特异性和灵敏性良好的iELISA抗体检测方法。