猪圆环病毒2型ORF2基因重组植物乳杆菌的构建及其免疫原性分析

为研制一种能有效控制猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的新型疫苗,本试验将PCV2的ORF2基因克隆至植物乳杆菌表达载体pSCPSP超强启动子SCP的下游,构建重组表达质粒pSCPSP-Cap,用电击转化法转化克隆至表达宿主菌植物乳杆菌,获得一株重组植物乳杆菌。以SDS-PAGE和Western blotting法检测24h上清液中表达的蛋白;将8周龄的SPF级BALB/c小鼠随机分组,每组8只,分别设置对照组、空载体组、灌胃组、饮水组、灭活疫苗组,试验14、28、42和56d后对小鼠采血,分离血清,利用PCV2ELISA抗体检测试剂盒检测小鼠血清中PCV2的抗体水平。SDS-PAGE、Western blotting结果显示,PCV2衣壳蛋白在植物乳杆菌中成功分泌表达,表达的蛋白分子质量为28ku,且具有良好的反应原性,重组植物乳杆菌免疫小鼠诱导机体产生PCV2特异性抗体显著高于其他组(P<0.05)。结果表明,PCV2的ORF2基因在植物乳杆菌中成功表达,且具有良好的生物活性,可为PCV2口服疫苗的开发研究提供理论参考。

猪繁殖与呼吸综合征病毒反向遗传操作系统的构建及应用综述

本文从猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作系统的构建及其在病毒基因功能研究、疫苗研制、病毒诊断等方面的应用作一综述。

定点改造的猪源胰高血糖素样肽-2基因在植物乳杆菌中的表达

根据pGLP-2基因序列,进行定点位点改造,即将pGLP-2的第二位的丙氨酸替换成甘氨酸,形成不被DPP-IV酶切的p(Gly2)-GLP-2,并进行植物乳杆菌(LP1)的密码子偏嗜性修饰,克隆至由超强启动子SCP驱动外源基因表达的植物乳杆菌表达载体p SCPSP,电转化表达宿主菌植物乳杆菌。通过基因组PCR方法鉴定后获得阳性重组转化子,将24 h培养上清通过Tricine-SDS-PAGE检测目的条带,并用pGLP-2ELISA特异性检测试剂盒检测24 h、36 h、48 h培养上清中目的蛋白的表达含量。结果,对pGLP-2成功进行了氨基酸的定点改造,形成了p(Gly2)-GLP-2,成功构建了表达载体p SCP-p(Gly2)-GLP-2;将质粒电转化入植物乳杆菌LP1后成功获得阳性转化子p SCPSP-p(Gly2)-GLP-2-LP1,在Tricine-SDS-PAGE试验中可观察到4 ku左右的目的条带;ELISA试验中p(Gly2)-GLP-2在24 h、36 h、48 h的表达量呈下降趋势,确定最佳表达时间为24 h。结果表明,本试验成功构建的由超强启动子SCP组成的表达系统,在宿主菌植物乳杆菌中成功表达了改造后的p(Gly2)-GLP-2,为pGLP-2的开发研究奠定了基础。

胸腺五肽在植物乳杆菌中的表达及其活性检测

根据胸腺五肽(TP5)的基因序列,进行植物乳杆菌(Lp1)密码子偏嗜性修饰,并克隆至由超强启动子SCP驱动外源基因表达的植物乳杆菌表达载体p SCPSP,电转化表达宿主菌植物乳杆菌。通过PCR筛选出阳性重组转化子,并用胸腺五肽ELISA特异性检测试剂盒检测重组植物乳杆菌16 h、20 h、24 h、28 h培养上清中目的蛋白的表达含量。用培养第12小时的乳杆菌灌胃刚断奶的SPF级BALB/c小鼠,每日1次,连续14 d,以小鼠的胸腺指数、脾指数和血清中IL-2的含量为指标检测TP5的生物活性。ELISA结果表明,在培养第24小时目的蛋白表达含量最高,且重组植物乳杆菌能显著增加小鼠的胸腺指数和血清中IL-2的含量,对脾指数无显著影响。结果表明,TP5在植物乳杆菌中成功表达,并有良好的生物活性。