1例胱氨酸尿症家系的临床表型和基因型分析

目的:通过分析1例胱氨酸尿症家系,探讨胱氨酸尿症的临床特征、诊治要点及遗传因素。方法:回顾分析1例胱氨酸尿症家系病例资料,先证者为28岁男性。通过尿沉渣镜检、能谱CT测定先证者结石成分,提取先证者及家系成员外周血DNA样本,利用目标序列捕获高通量测序技术筛查突变基因。结果:该家系先证者首诊于15岁。主要临床表现为复发性左侧泌尿道结石合并蛋白尿,其母亲主要表现为蛋白尿,父亲无肾脏受累症状。测序结果示先证者存在溶质载体家族3成员1(solute carrier family 3,member 1,SLC3A1)基因复合杂合突变,其中包括移码突变NM_000341:exon3:c.703delG(母亲为该杂合突变携带者)及错义突变NM_000341:exon8:c.1366C>T(父亲为该杂合突变携带者)。两突变均判定为疑似致病性变异。先证者有多次输尿管镜取石术史,尿沉渣镜检中可找到特异性胱氨酸六边形晶体,能谱CT结石成分测定为L-胱氨酸。先证者确诊为胱氨酸尿症后,予碱化尿液、降蛋白尿等治疗,目前病情稳定。结论:尿沉渣镜检中找到六边形晶体是胱氨酸尿症的特异性诊断手段,胱氨酸能谱CT可无创诊断胱氨酸结石。对起病年龄小的复发性结石患者应高度怀疑遗传疾病,基因检测是胱氨酸尿症的病因诊断方式。

SDS-AGE尿蛋白电泳与原发性IgA肾病病理的相关分析

目的:探讨十二烷基硫酸钠鄄琼脂糖凝胶电泳(SDS鄄AGE)法尿蛋白电泳检测在原发性IgA肾病(IgAN)的预后和随访中的应用价值。方法:对经肾病理确诊为原发性IgAN患者125例行SDS鄄AGE尿蛋白电泳,结合临床实验室检查及肾病理分型观察分析。结果:IgAN肾病理Hass分型示Ⅰ型15例,Ⅱ型28例,Ⅲ型52例,Ⅳ型20例,Ⅴ型10例。血清IgA水平各组间差异无显著性,除HassⅣ型24h尿蛋白高于各组外,余组无差异。血清肌酐(SCr)Ⅰ～Ⅴ型呈逐渐升高。尿蛋白电泳检测2例阴性,余均伴不同程度中、高分子性蛋白尿。混合性蛋白尿检出率在HassⅡ～Ⅴ型中呈升高趋势。中、高分子量蛋白条带和低分子量蛋白条带光密度值(D)分别在Ⅱ～Ⅴ型和Ⅲ～Ⅴ型中上升。讨论:IgAN中混合性蛋白尿检出率随病理肾损伤加重而增加,与SCr变化规律相似。中高分子蛋白排泄和低分子蛋白排泄也随之而逐渐增多,提示尿蛋白电泳可用于原发性IgAN的长期、动态随访,并有助于评估肾病预后。

血清β痕迹蛋白对肾小球滤过功能的评估

目的:研究血清β痕迹蛋白(βtrace protein,BTP)在肾小球滤过功能评估中的价值。方法:收集2004年2月至2005年4月间我科住院的慢性肾脏病患者108例,男:57例,女:51例,平均年龄(50.39±15.37)岁,以改进的免疫比浊法,测定BTP浓度。同时检测血肌酐(SCr)、血清胱抑素C(cystatin,CysC)、同位素99mTc-GFR(GFR),并用CG公式计算肌酐清除率(Ccr)、MDRD公式计算肾小球滤过率(eGFR)。以GFR为金指标,对上述检测方法行相关分析及受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析,计算ROC曲线下面积(AUC),比较各种检测方法的准确性,用四格表的卡方检验进行关联性的研究。结果:108例患者,血清BTP、Cys C、Ccr、eGFR和SCr的检测结果与GFR比较具有很好的相关性,相关系数分别为:-0.70、?0.82、0.79、0.81和?0.67,P均<0.01。BTP、CysC、eGFR、Ccr、SCr的AUC分别为0.913、0.889、0.878、0.864、0.846。在GFR<90 ml/min时,BTP、Cys C、Ccr、eGFR、SCr的诊断符合率分别是:86.11%、86.11%、92.59%、89.81%,72.22%。在GFR<60 ml/min时,其他指标的诊断符合率分别是BTP:81.5%、Cys C:79.6%、Ccr:76.8%、eGFR:77.7%,SCr:81.5%。结论:Ccr、eGFR与同位素99mTc-GFR等具有良好的相关性;BTP敏感性优于SCr;BTP检测方法简便快速,可作为评价肾功能不全的一项新指标,但仍需进一步研究。

Clara细胞分泌蛋白检测对急性肾小管坏死诊断的意义

目的:探讨Clara细胞分泌蛋白(CCSP)检测在诊断急性肾小管坏死(ATN)中的意义,以提高ATN的早期诊断率。方法:选取4例ATN患者肾活检组织,以原发性慢性肾小球肾炎[膜性肾病(MN)/微小病变(MCD)n=4]患者的肾脏及4例正常肾组织作为对照,应用免疫组化和免疫荧光方法检测肾脏组织的CCSP表达。选择10例ATN、10例原发性慢性肾小球炎(MN/MCD)和15例正常对照,采用ELISA法测定其血、尿CC16浓度,结果:免疫组化和免疫荧光结果显示,ATN组、MN/MCD组及正常对照组,肾小球中均无CCSP表达,肾小管上皮细胞有CCSP表达。而其中ATN患者则因肾小管受损,其肾小管上皮细胞CCSP表达较另2组下降。ATN患者起病期与肾功能恢复期间尿CC16差异有统计学意义[(1624.45±1119.11)ng/mL比(472.60±289.36)ng/mL,P<0.01]。尿CC16浓度在ATN起病期显著增高,与正常对照组、MN/MCD组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论:检测肾组织中CCSP有助于判断患者的肾小管功能,特别是近端肾小管受损情况:尿CC16浓度测定可作为急性肾小管损伤的指标,且与受检者肾组织中CCSP表达相吻合。

法布里病83例临床病理特点分析

目的了解法布里病（Fabry病）的临床病理特点。方法回顾性分析上海交通大学医学院附属瑞金医院2002年至2013年6月诊断收集的来自62个Fabry病家系83例Fabry病患者的临床、实验室及肾脏病理资料。结果83例患者中，男59例，女24例；平均年龄（33．1±12．9）岁，其中男（30．1±10．7）岁，女（40．6±14．9）岁。出现首发症状年龄为（18．1±14．5）岁，男性（16．1±13．6岁）早于女性（23．1±15．7岁），出现症状至诊断间隔时间分别为1～50年不等，平均（14．8±10．4）年。肢端疼痛为最常见的首发症状，其次为少汗、肾脏损害，经典型均以肢端疼痛和少汗为首发症状，迟发型首发症状多样。最常见临床症状为眼科病变，达79．5％，此后依次为肾脏损害74．7％、肢端疼痛67．5％、心脏损害56．3％、少汗51．8％、脑血管异常44．1％、听力下降40．6％，皮肤血管角质瘤36．1％、高血压34．9％、消化道症状22．9％。男性、经典型的临床表现分别较女性、迟发型重。40％的肾组织标本可见IgA沉积，易与原发性IgA肾病混淆。结论Fabry病发病早，临床表现多样，累及全身多个器官，不同性别临床表现存在很大差异，仍存在漏误诊现象。肾脏病理检查具有重要的诊断意义，需保证电镜组织，以减少漏误诊。

阻断IgG-FcγR结合短肽在抗中性粒细胞胞浆抗体促进中性粒细胞凋亡中的作用

目的利用阻断IgG-FcγR结合的短肽,观察FcγR在抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)促进中性粒细胞凋亡过程中的作用。方法人工合成短肽tg19320并鉴定其与人IgG的结合,玫瑰花环形成试验鉴定其阻断IgG-FcγR间的作用。提纯ANCA IgG并鉴定,体外分离健康人中性粒细胞。tg19320预处理经TNF-α预激的粒细胞1．5 h后,ANCA(200μg／ml)刺激粒细胞,分别在3、6、9、12和18 h收获细胞。流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位及凋亡细胞之Sub- G1峰变化,结合DNA缺口末端标记技术观察tg19320对ANCA促进中性粒细胞凋亡的抑制作用。结果(1)tg19320剂量依赖性与人IgG结合(P<0．01),并显著阻断IgG与FcγR的相互作用(玫瑰花环形成率20．3％比53．2％,P<0．01)。(2)正常粒细胞凋亡率随孵育时间增加,TNF-α在6 h前促进粒细胞凋亡而之后抑制粒细胞的凋亡:ANCA进行性促进经TNF-α预处理的粒细胞凋亡(P<0．01)。tg19320处理组粒细胞凋亡率在各时间点均低于ANCA作用组(P<0．01),而与正常对照组比较无显著差异。结论分支短肽tg19320可干预ANCA对中性粒细胞凋亡的促进, FcγR在ANCA促进中性粒细胞凋亡过程中具有关键作用。

皮肤基底膜α5（Ⅳ）链检测对Alport综合征诊断的意义

目的探讨皮肤基底膜α5（Ⅳ）链检测对疑似Alport综合征患者诊断的意义。方法回顾性分析2007年1月到2008年3月在我科行皮肤基底膜α5（Ⅳ）链检测的疑似Alport综合征患者的临床资料。结果共检测临床疑似患者254例（男性／女性，0．76），平均年龄为（25．85±17．03）岁（1～71岁），性别间的年龄差异无统计学意义。19例患者的皮肤基底膜α5（Ⅳ）链间接免疫荧光染色异常，阴性患者12例，阳性不连续患者7例，诊断为Alport综合征，诊断率为7．5％（19／254）。结论皮肤基底膜α5（Ⅳ）链检测能显著提高Alport综合征的诊断率，且可以为早期诊断和鉴别不同遗传类型提供帮助。

生物标志物组联合检测对心脏手术后急性肾损伤早期诊断检验效能研究

目的检测并评价手术后急性肾损伤(PO-AKI)患者尿液中巢蛋白(nestin)、中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白(NGAL)、尿损伤因子(KIM-1)、视黄醇结合蛋白(RBP)4种生物标志物对于急性肾损伤(AKI)早期诊断的检验效能。方法以2011年10月上海交通大学医学院附属瑞金医院心脏外科手术后的40例患者作为研究对象,其中男28例,女12例;年龄24～79岁,平均(56.15±12.83)岁。根据急性肾损伤网络工作小组(AKIN)定义分为AKI组和非AKI组。尿液生物标志物组的检测采用酶联免疫法(ELISA),同时检测实时尿肌酐值。结果 AKI发生率为25%(10/40),其中AKIN 1级7例、2级1例、3级2例,3级中2例均进行了肾脏替代治疗(RRT)。联合生物标志物组nestin、NGAL、KIM-1、RBP对于AKI的检测在24 h时间窗内明显升高(P<0.05),并且经尿肌酐(Ucr)校正后在6 h内升高更加显著(P<0.05)。结论联合生物标志物组对于AKI的检测在24 h内明显升高,经过Ucr校正后6 h升高趋势更加一致,对于早期判断AKI具有预警作用。

血β痕迹蛋白与其他评价肾小球滤过功能指标的比较

近年来有研究发现，β痕迹蛋白（BTP）在肾功能下降时明显升高、在血肌酐（Scr）正常时（所谓肌酐盲区）也已升高，BTP可能是提示GFR下降的一个早期检测指标。本研究通过检测不同肾功能患者的血清BTP水平，并与同位素^99m^Tc清除率（99m^Tc-DTPA）及Scr、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C（Cys C）、Cockcroft-Gault公式计算所得的肌酐清除率（Ccr）和简化MDRD公式计算所得的GFR进行比较，评价BTP作为肾功能不全检测指标的敏感性和准确性。

原发系统性抗中性粒细胞胞质抗体阴性小血管炎的临床病理表现

目的总结分析原发系统性小血管炎(PSV)抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)阴性小血管炎患者的临床病理特点,并与ANCA阳性患者进行比较,以提高对该类疾病的认识。方法回顾性总结并分析我科近7年来确诊的13例原发系统性ANCA阴性小血管炎的临床病理资料,并与同期30例ANCA阳性原发性小血管炎患者进行比较。结果ANCA阴性小血管炎组患者13例,占同期诊断的原发性小血管炎患者的7.14%。与ANCA阳性组相比,阴性组皮肤和消化道受损比率显著增高,而发热及中重度贫血发生率低于阳性组,阴性组蛋白尿水平高于阳性组,两组血管炎活动积分无差异。阴性组无一例血免疫球蛋白G升高,与阳性组相比差异有统计学意义(0vs50%,P<0.01)。阴性组肾脏新月体形成发生率低于阳性组,坏死和间质小管病变两组差异无统计学意义。两组免疫抑制治疗方案和临床缓解率差异无统计学意义。结论原发性ANCA阴性小血管炎并不罕见,毛细血管襻纤维素样坏死和无免疫球蛋白G升高有助于诊断。

利用阻断IgG-FcγR结合短肽抑制ANCA诱导中性粒细胞活化研究

目的观察阻断IgG-FcγR相互作用的分支短肽tg19320对抗中性粒细胞胞质抗体（ANCA）所诱导中性粒细胞呼吸爆发的抑制作用，为探讨原发性小血管炎的新型治疗方向提供依据。方法人工合成短肽tg19320并鉴定其与人IgG的结合；玫瑰花环形成试验观察tg19320对IgG与FcγR相互作用的阻断效应。提纯活动期原发性小血管炎患者的ANCA IgG，间接免疫荧光联合抗原特异性ELISA鉴定ANCA。Ficoll-Paque密度梯度分离健康人中性粒细胞。以肿瘤坏死因子（TNF）-α（2ng／ml）预激粒细胞后以ANCA IgG（200μg／ml）刺激诱发其呼吸爆发，tg19320组以2．5mg/ml tg19320预处理粒细胞45min，中性粒细胞呼吸爆发以Ferri-cytochromere／uctionassay法检测。结果①tg19320与人IgG呈剂量依赖性的结合（P〈0．01）。②tg19320显著阻断IgG与FγR的相互作用（玫瑰花环形成率20．3％vs53．2％，P〈0．01），与人IgG组差异无统计学意义（20．3％vs 19．7％．P〉0．05）。③tg19320显著抑制ANCA所致中性粒细胞的呼吸爆发（1．83nomels／10^6 cells vss 12．99nmoles／10^6 cells，P〈0．01）。结论分支短肽tg19320体外可阻断ANCA所诱导的中性粒细胞活化。

Alport综合征患者肾组织层粘连蛋白α2链异常分布

目的观察Alport综合征(AS)患者肾组织层粘连蛋白α2链、α5链和γ1链的分布。方法采用免疫荧光方法,运用普通荧光和激光共聚焦扫描显微镜观察抗层粘连蛋白α2链、α5链和γ1链单克隆抗体在肾组织中的沉积情况。肾组织标本来自11例AS患者,其中男8例,女3例,年龄11～52岁。10例患者符合X伴性显性遗传(XLAS),1例女性患者符合显性遗传。8例男性XLAS患者肾小球基底膜(GBM)、远端肾小管基底膜均无Ⅳ型胶原α3、5链沉积,表皮基底膜(EBM)无α5(Ⅳ)链沉积;2例女性XLAS患者肾组织α3、5(Ⅳ)链和EBMα5(Ⅳ)链均呈不连续表达,另1例女性患者则同正常肾组织。正常人肾组织标本作为正常对照,9例IgA肾病(IgAN)、6例局灶节段硬化性肾小球病(FSGS)、5例薄基膜病(TBMD)和6例肾小球轻微病变(GML)患者作为疾病对照。结果正常人肾组织层粘连蛋白α2链主要沉积于肾小球系膜区,层连蛋白α5、γ1链沉积于GBM、所有肾小管基底膜和入球小动脉基底膜。10例XLAS和1例显性遗传AS患者肾组织除了肾小球系膜区外,层粘连蛋白α2链在GBM上亦出现表达。IgAN、TBMD和FSGS患者层粘连蛋白α2链仅在肾小球系膜区沉积。层粘连蛋白α5、γ1链在AS患者和其他肾脏病组织沉积同正常肾组织。结论层粘连蛋白α2链在AS患者GBM出现异位表达,为继Ⅳ型胶原α链异常之后发现的又-AS基底膜成分的异常,其对于AS可能具有重要的诊断价值。

抗中性粒细胞胞质抗体对中性粒细胞表面FcγⅡ／Ⅲ受体表达的影响及其意义

目的探讨抗中性粒细胞胞质抗体（ANCA）对中性粒细胞表面FcγⅡ／Ⅲ（CD32／CD16）受体表达的影响及临床意义。方法提纯活动期ANCA相关性小血管炎（AASV）患者的ANCAIgG，分离健康人新鲜中性粒细胞，以ANCA刺激粒细胞1h后，流式细胞仪检测CD32／CD16的表达。流式细胞仪检测18例系统性小血管炎患者CD32／CD16的表达，以35名健康人为对照。同时对18例患者临床表现及血管炎活动情况进行评分，与CD32／CD16表达进行相关分析。结果ANCAIgG与正常人IgG相比显著上调中性粒细胞表面CD16的表达（Mnx67±23vss54±21，P〈0．01），但对CD32的表达无影响（Mnx21±8vs16±8，P〉0．05）。系统性小血管炎患者CD16表达的平均荧光强度显著高于正常人（Mnx62±12vs53±10，P〈0．01），而CD32的表达与正常人差异无统计学意义。CD16表达与伯明翰小血管炎呈显著正相关（P〈0．01）。结论ANCA相关性小血管炎患者高表达Fcγ受体，ANCA可以干预CD32／CD16受体的表达，调控Fcγ受体表达可能是系统性小血管炎的发病机制之一，监测CD16的表达水平对于判断疾病活动具参考价值。

阻断IgG-Fcγ受体结合的短肽对粒细胞与内皮细胞黏附及内皮细胞细胞间黏附分子1表达的影响

目的观察阻断IgG-Fcγ结合的短肽tgl9320对粒细胞与内皮细胞黏附以及内皮细胞细胞间黏附分子1（ICAM-1）表达的影响，并探讨其作用机制。方法培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。提纯活动期血管炎患者血清抗中性粒细胞胞质抗体（ANCA）IgG。以多肽固相合成tgl9320。分离健康人新鲜外周血中性粒细胞。分别以肿瘤坏死因子α（TNF-α）、健康人IgG、ANCA IgG 及ANCA IgG＋tgl9320处理HUVEC，用细胞直接计数法检测粒细胞与内皮细胞间的黏附率；应用Westem印迹及实时定量PCR方法检测HUVEC ICAM-1蛋白和mRNA表达；ELISA检测细胞培养上清液中可溶性ICAM-1（sICAM-1）的水平；Westem印迹检测HUVEC磷酸化核因子KB抑制物（p-IKB）的表达。结果ANCA IgG显著上调中性粒细胞与内皮细胞间的黏附率（P〈0.05），但ANCA IgG＋tgl9320组较ANCA IgG组黏附率显著降低（P〈0．05）。ANCA IgG组与健康人IgG组相比，HUVEC ICAM-1 mRNA及蛋白表达显著增加（P〈0．05）。tgl9320分别从mRNA和蛋白水平阻断ANCA对ICAM-1的作用（P〈0．05），并显著降低ANCAIgG引起的细胞培养上清液中sICAM水平增高（P〈0．05）。ANCA IgG增加HUVEC p-IκB表达，tgl9320显著降低p-IκB的表达。结论tgl9320通过抑制IκB磷酸化进而干预NF-κB活化；抑制ANCA IgG对内皮细胞与中性粒细胞间黏附的促进作用，并阻断ICAM-1上调表达。短肽tgl9320对原发性小血管炎具有体外保护作用。

肾脏疾病生物样本库信息化管理和应用

信息化管理应用于样本库能够为转化医学和遗传学研究提供扎实的基础,文章探索了信息化管理对提升肾脏疾病生物样本库规模与质量的作用。另外,介绍了样本库的标准化流程:经上海交通大学医学院附属瑞金医院伦理委员会批准,所有患者签署知情同意书。规范采集患者的外周全血及尿液,外周全血进行相应处理后获得血清、血浆和基因组DNA,对标本进行质量控制并从医院信息系统获得该患者详细临床资料后,将标本以及相应信息按照规范化流程入库,建立存录管理流程体系。本研究比较了2012年采用信息化科学管理后与之前的数据,提示信息化管理可以有效促进肾脏疾病样本库规模增长和标本质量提高,加快了生物样本库的建设和应用。

鼠源性髓过氧化物酶特异性抗中性粒细胞胞质抗体的制备及鉴定

采用鼠源性髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)与弗氏佐剂混合注射的方式制备小鼠MPO特异性抗中性粒细胞胞质抗体(anti-neutrophil cytoplasmic antibody,ANCA),并予以定性及定量检测。使用B6.129X1-Mpo^(tm1Lus)/J小鼠(即MPO敲除小鼠),将mMPO与完全/不完全弗氏佐剂混合,通过腹腔注射方式诱导小鼠产生适应性免疫应答。采用定性ELISA以及间接免疫荧光法检测小鼠血清ANCA水平;采用肌酐检测试剂盒(肌氨酸氧化酶法)检测小鼠血清肌酐水平以评估其肾功能。ELISA检测结果显示,实验组小鼠血清MPO-ANCA的光密度D(450 nm)值较对照组显著升高(P<0.001),约为对照组的5.6倍;间接免疫荧光法结果提示,实验组中性粒细胞胞质有较强的荧光信号,与MPO-ANCA的核周型特点相一致;H-E染色示部分肾小球囊壁层上皮细胞过度增殖;实验组与对照组小鼠血清肌酐水平检测结果差异不显著(P>0.05)。由此,注射MPO与弗氏佐剂混合液诱导MPO-/-小鼠产生了抗MPO-ANCA,ELISA和细胞免疫荧光实验均验证了抗体的生成,可为进一步构建实验性血管炎小鼠模型提供重要基础。