留学生医学微生物学实验教学的实践与反思

医学微生物学是临床医学专业的核心课程之一,医学微生物学实验是其重要组成部分,不仅有助于对理论知识的理解和掌握,而且有利于培养学生生物安全意识、临床思维、初步的科研设计和实验技能。本文就我校留学生的医学微生物学实验课程教学存在的一些问题,结合自身的教学经验,从多方面反思我们的教学活动,就如何提高留学生实验教学质量提出可行的措施。

病原生物学实验教学改革与实践

分析目前国内外病原生物学实验课现状,立足自身特点,在实验内容优化和整合、课程资源建设、教学方法和教学手段的改进、改革课程评价体系等方面进行了教学的改革和实践,调查问卷结果对改革效果予以肯定。

鼠伤寒沙门菌中假定转录调控因子的筛选

目的·基因组信息学分析结合分子生物学实验对鼠伤寒沙门菌中假定转录调控因子进行筛选,以期发现新的转录调控因子和调控机制。方法·通过沙门菌基因组信息分析筛选得到30个假定转录调控因子,利用λ-Red同源重组系统敲除各目的基因。酸耐受实验检测各敲除株在对数期酸耐受应答中的差异;细胞感染模型检测各敲除株上皮细胞入侵能力和巨噬细胞内复制能力;利用realtimePCR检测突变株中pho P及其下游基因的转录水平。结果·成功构建30个敲除株。ΔSTM14_0739、ΔSTM14_2717和ΔSTM14_1646对数期酸耐受能力较WT增强,ΔSTM14_1878、ΔSTM14_4338和ΔSTM14_1965则较WT减弱。ΔSTM14_0739和ΔSTM14_2717对He La细胞的入侵率降低,ΔSTM14_1878和ΔSTM14_2717在RAW264.7细胞内的24 h复制率提高。Realtime-PCR结果显示STM14_2717敲除并不影响pho P转录。结论·研究发现了新的转录调控因子,为深入研究沙门菌致病机制提供新的方向。

大肠埃希菌中λ-Red同源重组系统介导的trp和yfp基因融合表达的研究

目的为研究大肠埃希菌中色氨酸合成酶α亚基编码基因(trpA)的表达,利用λ-Red系统将trpA、黄色荧光蛋白基因(yfp)、氯霉素抗性编码基因(cat)融合片段敲入基因组中。方法将trpA、yfp、cat基因进行融合PCR,获得重组片段,转化入MG1655菌株中,利用pKD46编码的λ-Red系统将片段重组入基因组中,经PCR验证及测序鉴定正确后,荧光显微镜观察融合蛋白表达。结果成功获得trpA-yfp-cat重组片段,转化入MG1655菌株中获得阳性克隆,经测序鉴定正确。荧光显微镜观察可见细菌胞质内弥散分布黄色荧光,表明trpA-yfp融合表达片段成功地在MG1655菌株中表达。结论运用λ-Red系统可将trpA-yfp融合片段敲入MG1655菌株基因组中原位替换trpA基因,通过观察YFP蛋白的表达间接反映trpA基因的表达,具有不改变trpA基因自身功能和细菌生长的优点,为进一步研究大肠埃希菌色氨酸合成途径奠定基础。

鼠伤寒沙门菌中甲基化修饰调控PhoP活性的机制研究

目的·探究鼠伤寒沙门菌转录调控因子PhoP的甲基化修饰与其活性的相关性,筛选PhoP的甲基转移酶。方法·Westernblotting检测不同培养条件下鼠伤寒沙门菌中PhoP的甲基化水平变化。通过生物信息学预测候选的甲基转移酶,体内过表达预测的甲基转移酶后检测phoP及其下游基因的转录水平变化,找到可能的PhoP甲基转移酶,并体外验证该甲基转移酶能否甲基化PhoP。使用real-time PCR检测高浓度Mg^2+、弱酸性等培养条件下,phoP与其甲基转移酶在转录水平的相对表达变化。结果·随着培养基中Mg^2+浓度升高,PhoP甲基化水平上升;而经过弱酸刺激后,PhoP甲基化水平下降。生物信息学预测并筛选到9个甲基转移酶,其中体内过表达STM14_0023后,phoP及其下游基因的转录水平下降且PhoP蛋白水平也下降,但敲除STM14_0023对上述分子的表达无影响。体外甲基化酶促反应显示STM14_0023能够甲基化PhoP,体内过表达STM14_0023后也可提高PhoP的甲基化水平,且在抑制phoP表达的高浓度Mg2+培养条件下STM14_0023的转录水平升高。结论·STM14_0023是PhoP的甲基转移酶,甲基化修饰抑制PhoP活性。

乙酰化修饰在影响细菌对核糖体靶向抗生素敏感性中的作用

目的·探究乙酰化修饰在细菌应对核糖体靶向抗生素胁迫下的作用。方法·通过肉汤稀释法检测嘌呤霉素、巴龙霉素、四环素和壮观霉素对于鼠伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium,S.Typhimurium)14028S的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)。配置浓度低于各抗生素MIC的固体培养基。点板实验检测S.Typhimurium 14028S和3种乙酰化修饰相关基因敲除株[蛋白质乙酰转移酶(protein acetyltransferase,Pat)编码基因敲除株Δpat、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性去乙酰化酶(NAD+-dependent protein deacylase,CobB)编码基因敲除株ΔcobB、乙酸激酶(acetate kinase,AckA)编码基因敲除株ΔackA]在不同抗生素浓度的固体培养基上的生长差异。结果·乙酰化程度升高(ΔackA),增加S.Typhimurium对嘌呤霉素的敏感性,但会减弱S.Typhimurium对巴龙霉素的敏感性;而乙酰化程度升高(ΔackA、ΔcobB)或降低(Δpat)均不影响S.Typhimurium对四环素和壮观霉素的敏感性。结论·乙酰化修饰影响细菌对核糖体靶向抗生素的敏感性,这种改变可能是通过核糖体蛋白的乙酰化修饰来调控的。

综合性考评模式在“病原生物学实验”课程中的实施

合适的考评模式是打造“金课”,圆满达成课程目标的重要保证。本校积极探索适合“病原生物学实验”课程的考核评价方法,促进实验课教学效果进一步提高。研究对象为采用终结性考评模式的2015级临床医学五年制学生和采用形成性评价与终结性评价相结合的综合性考评模式的2017级临床医学五年制学生。对学生的病原生物学实验期末操作考试成绩和课程问卷调查进行分析。考试平均分由82.0±9.05分提高到87.7±9.35分,两者之间有显著差异(P<0.01),而且学生对考评模式的满意度由86.9%提高到98.0%,充分说明综合性考评模式能激发学生主动学习的热情,对“病原生物学实验”课程教学有明显促进作用。