多发性骨髓瘤和白血病细胞中白细胞介素-6激活的核因子活性比较

用阻滞电泳方法检测IL6激活的核因子,以比较在多发性骨髓瘤细胞系SKO007和转染IL6受体基因的T淋巴母细胞白血病细胞系Molt4中IL6信号转导的差异。结果表明,在SKO007细胞中,核因子可与双链探针APRE,SIE(m67)和NFIL6RE结合,被激活的核因子的量与IL6受体的水平正相关;而在转染IL6受体基因的Molt4细胞中,核因子只与APRE和NFIL6RE结合,而不与SIE(m67)结合。可见,IL6在SKO007和Molt4细胞中的信号转导途径是有差异的。

肿瘤细胞系IL-6Rα/IL-6Rβ基因表达的生物学效应

应用非同位素原位杂交技术及反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ），检测了１１种肿瘤细胞系上ＩＬ－６Ｒα／ＩＬ－６ＲβｍＲＮＡ的表达情况，同时应用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测了ＩＬ－６Ｒα／ＩＬ－６Ｒβ蛋白的表达。结果表明，１１种细胞系中有６种细胞系检测到ＩＬ－６ＲαｍＲＮＡ的表达，有５种细胞系有ＩＬ－６ＲβｍＲ－ＮＡ的表达，有两种细胞系中均没有表达，在蛋白检测中得到同样的结果。生物学活性检测发现，在细胞系中只有当ＩＬ－６Ｒα／ＩＬ－６Ｒβ亚基同时在细胞中表达，而且表达量具有一定合适比例时，才能对一定浓度的ＩＬ－６刺激产生明显的生物学效应。

hIL-6·hIL-6Rα·gp130三元复合物的结构预测

通过Delphi方法分析人白介素 6 (humaninterleukin 6 ,hIL 6 ) /人白介素 6受体α亚基 (humaninterleukin 6receptorαsubunit,hIL 6Rα)复合物、gp130 (βsubunit)的空间构象的表观静电分布 ,利用分子对接方法研究 gp130与hIL 6 /hIL 6Rα复合物作用形成三元复合物的空间构象 ,经过分子力学优化、分子动力学常温动态模拟借助分子间相互作用 (范德华力、氢键、盐键等 )、反应自由能理论探讨hIL 6·hIL 6Rα·gp130复合物稳定构象结合部位的结构域 .分析结果表明 ,gp130蛋白表面富集较强的负电势 ,复合物hIL 6 /hIL 6R一侧表面富集较强的正电势 ,gp130借助蛋白表面的静电作用结合hIL 6 /hIL 6R复合物 ,介导hIL 6信号 ;hIL 6中的helix C、loop BC、loop CD参与同 gp130中的loopEF、linker、loopA′B′、loopB′C′、loopD′E′作用 ,hIL 6R中的loopA′B′、β strandE′参与同gp130中的loopA′B′、β strandE′作用 .

抗人gp130分子单克隆抗体的制备和鉴定

目的 gp130(亦称CD130)可与许多细胞因子受体(IL 6R,IL 11R,OSMR,LIFR,CNTFR和CT 1R)组成受体复合物,并在这类细胞因子的信号转导中起着重要的作用。方法以痘苗病毒为载体构建获得的可溶性CD130(sCD130)为免疫原 ,通过细胞融合的方法 ,得到4株稳定分泌抗CD130单克隆抗体(mAb) (L2,L4a,L4b和L5)的杂交瘤细胞株。结果本组mAb对靶细胞具有识别特异性 ,不但可识别相对分子质量 (Mr)为98000的sCD130分子,也可识别Mr为130000的膜表达型CD130分子(mCD130)。另外 ,mAb还可与CD130分子形成免疫复合物 ,用于免疫沉淀CD130分子 ,但这组抗体中仅mAbL2可部分组断IL 6对靶细胞的增殖作用。结论成功地研制了抗人gp130分子mAb。

sgp130 cDNA在痘苗病毒载体系统中的表达

ｇｐ１３０是一种分子量为１３０ｋＤ的细胞膜糖蛋白，是ＩＬ－６等多种细胞因子共用的信号传递分子。本研究将含ｇｐ１３０胞外区全长的可溶性片段的基因（ｓｇｐ１３０ｃＤＮＡ）构建到痘苗病毒载体中，并与野生型痘苗病毒在ＴＫ－１４３细胞中发生同源重组，用ＢｕｄＲ和Ｘ－ｇａｌ双重选择，得到带有人ｓｇｐ１３０的重组痘苗病毒（Ｖｓｇｐ１３０）。采用ＩＤＡ和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｉｎｇ法证实：感染Ｖｓｇｐ１３０的ＴＫ－１４３细胞上清中有较强的ｓｇｐ１３０表达，表达产物分子量为１００ｋＤ左右。

可溶性白细胞介素6受体β亚基在重组痘苗病毒中的表达及其对动物的免疫效果

目的 :构建可溶性白细胞介素 6受体 ( IL- 6R) β亚基 ( sgp130 )重组痘苗病毒 ,感染动物细胞使其表达 sgp130 ,用重组病毒免疫动物产生特异性抗 sgp130抗体。 方法 :将 sgp130基因导入痘苗病毒载体 p JSA1175,用脂质体转染法将重组载体与野生型痘苗病毒在 TK-143细胞中发生同源重组 ,用 Bud R和 X- gal双重选择 ,得到带有人 sgp130的重组病毒 ( Vsgp130 )。 结果 :采用 IDA和 Western Blotting法证实 ,感染 Vsgp130的 TK-143细胞上清中有较强的 sgp130表达 ,表达产物分子量为 10 0 0 0 0左右。用重组病毒免疫家兔和 Balb/c小鼠 ,可刺激抗体产生。 结论 :sgp130在痘苗病毒载体系统中的表达成功及抗 sgp130多克隆抗体的产生为进一步研究 IL- 6等细胞因子信号传导机理及研制抗

可溶性白细胞介素6受体β亚基在重组痘苗病毒中的表达及其对动物的免疫效果

目的：构建可溶性白细胞介素６受体（ＩＬ－６Ｒ）β亚基（ｓｇｐ１３０）重组痘苗病毒，感染动物细胞使其表达ｓｇｐ１３０，用重组病毒免疫动物产生特异性抗ｓｇｐ１３０抗体。方法：将ｓｇｐ１３０基因导入痘苗病毒载体ｐＪＳＡ１１７５，用脂质体转染法将重组载体与野生型痘苗病毒在ＴＫ－１４３细胞中发生同源重组，用ＢｕｄＲ和Ｘ－ｇａｌ双重选择，得到带有人ｓｇｐ１３０的重组病毒（Ｖｓｇｐ１３０）。结果：采用ＩＤＡ和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｉｎｇ法证实，感染Ｖｓｇｐ１３０的ＴＫ－１４３细胞上清中有较强的ｓｇｐ１３０表达，表达产物分子量为１０００００左右。用重组病毒免疫家兔和Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，可刺激抗体产生。结论：ｓｇｐ１３０在痘苗病毒载体系统中的表达成功及抗ｓｇｐ１３０多克隆抗体的产生为进一步研究ＩＬ－６等细胞因子信号传导机理及研制抗ｓｇｐ１３０单克隆抗体奠定了基础。

gp130胞外区两个片段的克隆与表达及其对IL-6信号转导的影响(英文)

gp130是白细胞介素6(IL-6)受体的β亚基和信号转导子。IL-6介导的信号转导起始于gp130与IL-6和IL-6Rα形成的复合体,但目前还不了解gp130分子中参与复合物形成的部位。为了研究gp130胞外区的结构与功能,我们通过PCR方法构建并克隆表达了其胞外区全长(大片段)及氨基端304个氨基酸残基的片段(小片段),并在杂交瘤细胞系7TD1和肝癌细胞系HepG2中观察其生物学效应。结果发现,含细胞因子结合区的可溶性小片段和大片段都能与膜结合型gp130竞争性结合IL-6和IL-6Rα,拮抗IL-6信号。可见gp130氨基端304个氨基酸残基的片段中存在与IL-6和IL-6Rα作用的部位。

可溶性白细胞介素6受体β亚基拮抗IL-6信号的研究

gp130是白细胞介素6(IL-6)受体的β亚基和信号转导子。IL-6介导的信号转导起始于gp130与IL-6、IL-6Ra形成的复合体。为了研究gp130胞外区的结构与功能,我们克隆并表达了其胞外区全长及氨基端304个氨基酸残基的片段,并在白血病R2细胞、杂交瘤细胞和肝癌细胞中观察其生物学效应。结果发现,两个片段均拮抗IL-6信号,从而,证明了含细胞因子结合区的可溶性小片段和大片段都能与膜结合型gp130竞争性结合IL-6、IL-6Ra,拮抗IL-6信号;它们与可溶性IL-6R α的效应正好相反。

可溶性gp130和gp130反义核酸对IL-6诱导的靶基因启动子活性的影响

ｇｐ１３０是ＩＬ－６信号转导子，ＩＬ－６介导的信号转导起始于ｇｐ１３０与ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒα形成的复合物。为了研究ｇｐ１３０胞外区的结构与功能，在肝癌细胞ＨｅｐＧ２中建立了检测ＩＬ－６诱导基因表达强弱的方法，并观察了含胞外区全长（５９７个氨基酸）及氨基端３０４个氨基酸残基的ｇｐ１３０突变体，以及ｇｐ１３０反义核酸对ＩＬ－６生物学效应的影响。证明两个突变体和反义核酸均拮抗ＩＬ－６信号，为进一步研究ＩＬ－６受体拮抗剂奠定了基础。

GP130与IL-6信号途径

IL-6受体两个亚基IL-6Rα和gp130组成。IL-6与之形成三元复合体,然后激活与gp130相偶联的Jak家族的酪氨酸激酶,诱发系列的磷酸化事件,激活Ras途径及新发现的不依赖Ras的途径,即直接激活STAT家族成员APRF等,然后,诱导靶基因表达。

白细胞介素6及其受体在多发性骨髓瘤患者外周血中的表达及作用

本研究测定了多发性骨髓瘤（ＭＭ）患者血清的白细胞介素６（ＩＬ６）及ＩＬ６Ｒ水平，以及外周血单个核细胞（ＰＭＮＣ）中ＩＬ６和ＩＬ６Ｒ的ｍＲＮＡ表达，并通过凝胶阻滞电泳（ＥＭＳＡ）的方法对病变条件下ＩＬ６与ＰＭＮＣ核内急性期蛋白反应因子（ＡＰ...

可溶性IL-6RB亚基突变体在CHO细胞中的表达及活性研究

目的 弄清只含白细胞介素 6 (IL 6 )受体 β亚基 (gp130 )胞外第二、三个FNⅢ区的可溶性突变体是否能拮抗IL 6的生物学效应。方法 首先用重叠延伸PCR方法扩增出gp130突变体cDNA ;接着将其克隆到真核表达载体pSVL中 ;用脂质体转染法将此表达载体导入CHO细胞中 ,通过点杂交和反转录PCR证明其得到有效表达 ;用MTT法在杂交瘤细胞和白血病细胞中观察了此突变体对IL 6生物学效应的影响。结果 发现此突变体的表达上清具有拮抗IL 6所致的杂交瘤细胞 7TD1增殖及白血病细胞R2生长抑制的作用。结论 gp130胞外第二、三个FNⅢ区中含有与IL 6 /IL 6Rα形成复合物的部位。此结果为深入研究gp130胞外区的结构与功能以及针对gp130胞外区的小分子激动剂和拮抗剂的设计提供了一些依据。

膜结合型白细胞介素6受体β亚基突变体的构建及其对白细胞介素6信号的影响

目的 探讨只含白细胞介素 6 (IL 6 )受体 β亚基 (gp130 )胞外第二、三个FNⅢ (CBD)区的膜结合型gp130突变体 (mgp130 )能否传导IL 6信号。方法 首先用重叠延伸PCR方法扩增出mgp130cDNA ,将其克隆到真核表达载体pRc RSV中 ;用脂质体转染法将此表达载体导入骨髓瘤细胞系SKO 0 0 7和Jurkat细胞中 ,通过点杂交证明其得到有效表达 ;用阻滞电泳法比较野生型gp130和mgp130分子传导IL 6信号的情况。结果 在SKO 0 0 7细胞中IL 6能激活APRF ,而将野生型和突变的gp130cDNA的表达载体分别导入细胞后 ,APRF活性均得到增强 ,但野生型gp130增强的程度较突变体为高 ;在Jur kat细胞中IL 6不能激活核因子 ,导入野生型和突变的gp130cDNA的表达载体后 ,IL 6能激活APRF ,但不能激活NF IL6。与SKO 0 0 7细胞的结果类似 ,野生型gp130激活的信号强于突变体。结论 只含胞外CBD区的mgp130 ,尽管仍能传导IL 6信号 ,但其效率远低于野生型gp130 ,因此gp130的免疫球蛋白样区在IL 6转导中也起着十分重要的作用。

IL-6信号转导与转录激活子活性研究

目的 探讨 Ｉ Ｌ６ 生物效应与胞内磷酸化蛋白和转录激活子活性变化之间的关系。方法 应用原位杂交和 Ａ Ｐ Ａ Ａ Ｐ 方法检测细胞内 Ｉ Ｌ６ Ｒ ｍ Ｒ Ｎ Ａ 和蛋白的表达；采用 Ｄ Ｎ Ａ 结合蛋白凝胶阻滞电泳分析 Ｉ Ｌ６ 信号转导与 Ａ Ｐ Ｒ Ｆ 活性的相关性；用免疫沉淀和 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 观察 Ｉ Ｌ６ 信号转导中磷酸化蛋白的变化情况。结果 （１） Ｉ Ｌ６ 受体（ Ｉ Ｌ６ Ｒ） ｍ Ｒ Ｎ Ａ 和蛋白表达阳性的人骨髓瘤细胞系（ Ｓ Ｋ Ｏ００７） 体外对 Ｉ Ｌ６ 有增殖反应；（２） 胞内转录激活子活性与 Ｉ Ｌ６ 诱导时间和剂量有相关性，抗ｇｐ１３０ 单克隆抗体和酪氨酸蛋白激酶抑制剂均可特异性抑制转录激活子活性；（３） Ｉ Ｌ６ 诱导 Ｓ Ｋ Ｏ００７细胞后，胞浆内出现一组相对分子质量为（１３０ 、９０ 、５４ 、３６） ×１０３ 磷酸化蛋白，它们的磷酸化活性与转录激活子活性一样，也具有时间和剂量相关性。结论 结果提示，转录激活子和这组相对分子质量不同的酪氨酸磷酸化蛋白参与 Ｉ Ｌ６ 信号转导调节。

gp130胞外区近膜端缺失的突变体介导IL-6信号的研究

目的研究ｇｐ１３０胞外区远膜端和近膜端在ＩＬ－６信号转导中的作用。方法用分子克隆手段构建全长的膜结合型ｇｐ１３０分子和胞外区第３０１～５８２位氨基酸残基缺失的突变体分子，并通过阻滞电泳方法比较突变体与野生型分子在传导信号方面的差异。结果通过酶切鉴定、序列分析和表达检测，证明野生型和突变体ｃＤＮＡ表达载体构建正确，并有效表达；阻滞电泳结果表明，在ＳＫＯ－００７细胞和Ｍｏｌｔ－４细胞中，突变体分子与野生型ｇｐ１３０都能介导ＩＬ－６信号。结论ｇｐ１３０分子胞外区远膜端在ＩＬ－６信号转导中发挥重要作用；而近膜端并非ＩＬ－６信号转导所必需。

新生mRNA分析方法的建立与初步应用

目的在转录水平上分析某种信号引起细胞特定基因表达改变的量效关系。方法采用ＳＫＯ００７细胞，逐一对无损细胞核的制备、新生转录反应和［α３２Ｐ］标记新生ｍＲＮＡ的提取等关键步骤进行了方法学研究，并对我室研究白细胞介素（ＩＬ）６信号转导机制的常用细胞系ＩＬ６、ＩＬ６受体（Ｒ）α、ＩＬ６Ｒβ的表达进行了鉴定。结果１×１０５细胞即可得到阳性杂交信号，细胞数在５×１０５～１×１０７范围内，其杂交信号随细胞数的增加而增强，线性及重复性满意。常用细胞系除Ｍｏｌｔ４外，均有不同程度的ＩＬ６、ＩＬ６Ｒα和ＩＬ６Ｒβ表达。结论所建立的方法在受试细胞数仅为国外报道的十分之一时即可完成操作，且操作相对简单，易为人们接受。