转录因子GRHL3调控GPR108基因表达及其作用机制

目的研究转录因子果蝇头状因子(grainyhead-like,GRHL)3调控G蛋白偶联受体108(G protein-coupled receptor 108,GPR108)表达的分子机制。方法利用生物信息学分析在各种癌症组织的肿瘤细胞中,GRHL3和GPR108的表达水平以及相互关系;运用反转录定量聚合酶链反应(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测GRHL3和GPR108基因在人皮肤鳞癌细胞系(A-431)、人肝癌细胞系(Hep G2)以及人神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y)的表达;采用分子克隆技术构建含有GPR108基因启动子和突变型GPR108基因启动子的荧光素酶报告基因表达载体;通过双荧光素酶报告基因检测系统,观察GRHL3对GPR108基因启动子的调控作用;通过染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)分析GRHL3和GPR108启动子结合位点之间的关系。结果生物信息学分析在各种组织的肿瘤细胞中,GRHL3的表达较低,而GPR108的表达较高。利用分子克隆技术成功构建了GPR108基因启动子和突变型GPR108基因启动子荧光素酶报告基因表达载体;GRHL3对荧光素酶报告基因GPR108的启动子具有明显的抑制作用。将GPR108启动子上的结合位点删除突变后,GRHL3对GPR108基因启动子的负调控作用减弱;ChIP结果显示GRHL3能与GPR108启动子结合位点结合。结论转录因子GRHL3通过结合GPR108启动子上的保守序列5′-AACCGGTG-3′抑制GPR108表达。

人G蛋白偶联受体107表达载体构建及细胞定位的研究

目的克隆人G蛋白偶联受体107(GPR107)基因以构建真核表达载体,并探讨GPR107在真核细胞中的亚细胞定位。方法通过分子克隆技术克隆人GPR107基因的cDNA;利用真核细胞表达载体pCMV-Tag2B构建重组载体pCMV-Tag2B-GPR107,瞬时转染至293T细胞,Western blot检测GPR107的表达变化;采用免疫荧光标记,激光共聚焦显微镜观察GPR107在细胞中的定位。结果经过基因测序证实获得人GPR107的cDNA;成功构建真核表达载体pCMV-Tag2B-GPR107;Western blot结果显示,与未转染组比较,转染组GPR107表达量明显上调。激光共聚焦显微镜观察显示GPR107主要表达于细胞质。结论GPR107在293T细胞中过表达,并定位于细胞质。

硒代胱氨酸减轻小鼠短暂局灶性脑缺血再灌注损伤的研究

目的:探讨硒代胱氨酸(SeC)对小鼠短暂局灶性脑缺血再灌注(transient focal cerebral ischemia/reperfusion,tFCI/R)损伤的神经保护作用及机制。方法:线栓阻塞昆明小鼠大脑中动脉1 h后拔除,制作tFCI/R模型。通过多普勒血流监测和神经功能缺损评分筛选手术合格小鼠40只,按照随机数字表法分为SeC治疗组和tFCI/R模型对照组;另选20只作为假手术组(Sham组,小鼠经历手术全程而不阻塞大脑中动脉)。SeC治疗组小鼠给予术后0 h、24 h、48 h各1次腹腔注射SeC溶液(2 mg/30 g);模型组和Sham组小鼠给予同样方式注射等量生理盐水。于术后24 h、48 h、72 h每组各随机抽取6只小鼠进行神经功能缺损评分及神经行为学测试;之后所有小鼠麻醉处死取脑,行氯代三苯基四氮唑(TTC)染色测脑梗死体积,湿-干重法测脑水肿程度变化,Tunel-DAPI染色观察神经元凋亡情况,Western blot检测活性caspase-3和PARP表达,并检测小鼠脑组织GSH、GSH-Px表达情况。结果:Sham组小鼠未见神经功能缺损表现,术后24 h、48 h、72 h的tFCI/R组Zea Longa评分[(3.67±0.52)分,(3.33±0.52)分,(2.17±0.41)分]均比Sham组[(0.50±0.55)分,(0.67±0.52)分,(0.33±0.52)分]显著提高(t=10.26,8.86,6.81,均P<0.05),而SeC治疗组评分[(2.50±0.55)分,(1.67±0.82)分,(0.83±0.75)分]则比tFCI/R组显著降低(t=3.74,4.19,3.84,均P<0.05)。行为学评测结果与Zea Longa评分一致。术后72 h TTC染色显示:与tFCI/R组[(24.69±2.25)%]比较,SeC治疗组[(11.89±1.64)%]脑梗死体积明显缩小,差异有统计学意义(t=10.28,P<0.05);Sham组无梗死灶形成。湿-干重测量显示:与Sham组相比,tFCI/R组左侧脑组织含水量[(85.87±1.36)%]明显增加(t=8.73,P<0.05),SeC治疗组左侧脑组织含水量[(81.06±1.07)%]与tFCI/R组比较下降,差异有统计学意义(t=6.22,P<0.05)。Tunel-DAPI染色、Western blot结果表明,SeC处理显著下调了caspase-3和PARP的裂解,从而抑制了神经元凋亡。脑组织GSH含量检测证实,与tFCI/R组[(64.69±2.15)%]比较,SeC治疗组GSH含量[(85.83±1.46)%]显著提高,差异有统计学意义(t=18.19,P<0.05)。脑组织GSH-Px活性检测证实,与tFCI/R组[(38.74±1.93)%]比较,SeC治疗组GSH-Px活性[(49.12±1.13)%]显著提高,差异有统计学意义(t=10.38,P<0.05)。结论:SeC通过抑制氧化应激和凋亡,对tFCI/R诱导的脑损伤发挥了有效的神经保护作用,据此推测SeC在脑卒中的防治方面具有潜在的应用价值。