肿瘤细胞系血管内皮生长因子及其受体共表达的研究

背景与目的:血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)旁分泌在肿瘤血管新生中的作用已得到证实,但其自分泌作用尚不清楚。本研究的目的是分析VEGF及其受体(Flt-1和KDR)基因在恶性肿瘤细胞系中的共表达。方法:以看家基因为内标,采用半定量逆转录-聚合酶链反应分析VEGF及其受体基因在30种肿瘤细胞系和4种内皮细胞中的表达水平。结果:在29种肿瘤细胞系和3种内皮细胞系检测到中度以上的VEGF基因表达,而人脐静脉内皮细胞仅有低表达;Flt-1基因表达分别见于50%(6/12)的血液肿瘤,28%(5/18)的实体瘤细胞和2种内皮细胞;仅在16.7%(2/12)的血液肿瘤,33.3%(6/18)实体瘤细胞和2种内皮细胞检测到KDR基因表达;而ECV304细胞并无Flt-1或KDR基因的表达。结论:VEGF基因高表达是肿瘤细胞的重要特征,而VEGF及其受体共表达表明肿瘤细胞系中存在自分泌途径。

基于层次分析法-灰色聚类的无线网络安全风险评估方法

无线网络安全风险评估由于各类评价指标的子因素较多,且存在模糊性和相对性,采用传统的风险评价方法难以达到直观量化的要求.采用基于层次分析法(AHP)和灰色聚类相结合的风险评估方法,首先对无线网络中的各种安全聚类指标进行层次化分析,量化出各层指标的权重,再采用灰色聚类的方法进行聚类分析,得出无线网络的风险值,从而确定网络的安全情况.结果表明,该方法是一种有效的无线网络安全风险评估方法.

增强型绿色荧光蛋白逆转录病毒载体的构建和表达

逆转录病毒载体被广泛用作对造血细胞进行基因转移的工具 ,转导方法的改进有赖于应用可快速分析并被高效选择的基因标志。为此 ,我们克隆了增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因 ,并构建可表达EGFP的逆转录病毒载体LGSN ,通过脂质体转染和交互感染方法建立高滴度的逆转录产病毒细胞 ,用以分析对造血细胞标记EGFP基因的可行性。流式细胞术和荧光显微镜检测发现 ,EGFP病毒转录的GP +envAm12细胞和K5 62细胞均可发出稳定的绿色荧光信号 ,阳性率可分别达 97%和 86% ;聚合酶链反应分析显示LGSN转导细胞内有原病毒的整合。上述结果提示 ,作为新一代选择性标志 ,EGFP是适于研究对造血细胞基因转移与表达的报告基因 。

Wilms瘤基因WT1表达与急性白血病微小残留病的检测

近年来发现急性髓性白血病 (AML)有Wilms瘤抑制基因WT1的异常表达 ,且表达水平与预后呈负相关 ,提示其可作为一种新的白血病标志。为探讨WT1能否作为急性白血病微小残留病 (minimalresidualdisease ,MRD)的标志 ,我们采用巢式逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)测定了WT1基因的灵敏度 ,并与肿瘤特异性标志基因进行比较。所有样本RNA的质量均用内对照c abl基因证实。以两轮RT PCR扩增WT1和肿瘤特异性融合基因检测白血病细胞的极限在NB4细胞分别为 10 -4 和 10 -5,而在K5 62细胞分别为 10 -3- 10 -4 和高于 10 -6 ;在 2 9例供血员的外周血单个核细胞 (MNC)均未检测到WT1基因表达 ,但在 2 1例非恶性疾病患者骨髓MNC中有 8例呈WT1基因阳性 (38.1% )。本研究提示 ,监测WT1表达可用于AML的疗效评价及MRD随访 。

造血细胞表达血管内皮生长因子及其受体基因的研究

目的 探究血管内皮生长因子 (VEGF)及其受体Flt 1和KDR基因在造血细胞中的表达。方法 提取正常外周血、骨髓单个核细胞及血液肿瘤细胞系的总RNA ,以 β2 微球蛋白基因为内标 ,用半定量逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)分析VEGF ,Flt 1和KDR基因的表达。结果 在 2 2份正常外周血和 2 2份非恶性骨髓标本中 ,分别有 18份和 19份表达VEGF基因 ,而 10种人类血液肿瘤细胞系均有VEGF基因的高度表达。在 12份外周血中 ,有 4份检测到Flt 1基因表达 ,但均未见有KDR基因表达 ;在 2 2份骨髓中 ,分别有 9份和 14份表达Flt 1基因或KDR基因。 10种血液肿瘤细胞系有 6种表达Flt 1基因 ,而KDR基因表达仅见于Raji细胞。血小板也有VEGF和Flt 1基因的低度表达。结论 VEGF作为血管生成的介导物 。

内皮抑素基因逆病毒载体的构建及其在白血病细胞中的表达

目的 探究内皮抑素基因转移在白血病抗血管新生治疗中的价值。方法 构建分泌型内皮抑素的表达载体,联合脂质体转染与交互感染建立逆病毒介导的内皮抑素基因转移系统,并用内皮抑素病毒分别感染白血病细胞WEHI-3B和K562;用聚合酶链反应(PCR)检测靶细胞中内皮抑素基因的整合与表达。结果 脂质体转染与交互感染策略分别获得单嗜型(GP+E-86/ES)和双嗜型(Am12/ES)病毒生产细胞,后者上清的病毒滴度约为7.8×105CFU/ml;内皮抑素病毒感染、G418选择得到内皮抑素基因修饰的WEHI-3B细胞和K562细胞,PCR分析显示两者均有内皮抑素基因整合并持续表达。结论 逆病毒载体有效介导白血病细胞表达内皮抑素,可用于血液肿瘤的血管抑制基因疗法研究。

流式细胞术快速测定逆转录病毒滴度的研究

目的 建立一种快速测定逆转录病毒滴度的方法。方法 用通过乒乓转导获得的逆转录病毒 (G1FP ,LGSN ,CD87)分别感染NIH 3T3受体细胞 ,以流式细胞术 (FCM )定量分析受体细胞中绿色荧光蛋白 (EGFP)或CD87的表达 ,并与常规的耐药集落形成法进行比较。结果 PT6 7/G1FP细胞高度表达EGFP ,荧光强度较对照细胞提高 10 5 1倍 ;G1FP - 8,Am12 /G1FP ,PT6 7/G1FP ,Am12 /LGSN和Am12 /CD87细胞上清中病毒滴度分别为 2 .9× 10 6,1.1× 10 5,2 .0× 10 6,1.5× 10 5和 4.3× 10 5感染性颗粒 /ml,比集落形成法测得的滴度低 3～ 6倍。结论 FCM分析抗原表达是测定逆转录病毒滴度的有效方法 ,特别适宜于缺乏选择性基因的载体。

EDTA肝素抗凝剂对13项生化指标的影响

ＥＤＴＡ肝素抗凝剂对１３项生化指标的影响傅建新，谢国强（江苏省血液研究所，江苏苏州２１５００６）抗凝剂的选择是医学检验质量保证的重要环节。有资料表明［１，２］，血清与血浆多个指标的测定值存在差异，甚至可得到与实际相反的结果。本文探讨乙二胺四乙酸二钠（...

多药耐药基因在白血病细胞的高效转移与表达研究

目的 研究逆转录病毒介导多药耐药基因 MDR1的转移与表达。方法 用 MDR病毒转导人类白血病细胞K5 6 2和 NB4,获得耐药细胞系 ;外源性 MDR1基因的转移和表达用聚合酶链反应 (PCR)、流式细胞术 (FCM)和半固体集落培养法分析。结果 MDR病毒转导使白血病细胞获得经典多药耐药表型 ,78.0 %～ 98.7%的细胞表达 P-糖蛋白 ;PCR分析证实耐药细胞整合有 MDR原病毒 ,并共表达全长和异常剪切 MDR1转录本。以 K5 6 2细胞为模型 ,FCM和集落培养法发现共培养法的基因转导率 (6 7.9%～72 .5 % )明显高于上清法 (33.1%～ 46 .8% ) ,加入生长因子可提高基因转导率约 2 3%。结论 逆转录病毒可介导MDR1基因在髓系白血病细胞进行有效的转移与表达 ;

IV型胶原片段阻滞原的基因克隆及原核表达研究

目的 克隆中国人阻滞原基因并高效表达。方法 利用高保真聚合酶链反应 (HF -PCR)从胎肝细QSD胞克隆IV型胶原α1链NC1结构域编码序列 ,即阻滞原基因 ,并进行序列分析。将阻滞原基因克隆入表达载体pQE - 3 1,转化大肠杆菌M 15 [pREP4]并用IPTG诱导蛋白表达 ,蛋白电泳鉴定重组阻滞原蛋白。 结果 从胎肝细胞克隆的人阻滞原基因长 687bp ,编码 2 2 9个氨基酸 ;大肠杆菌表达的重组阻滞原N -末端与载体编码的组氨酸标签形成融合蛋白 ;SDS -PAGE分析显示 ,经IPTG诱导后可出现 2 8kd的目的蛋白条带 ,最高可占总菌体蛋白的 3 2 %。结论 该法可成功克隆阻滞原基因 。

T-载体在聚合酶链反应扩增产物克隆中的应用

目的 探讨克隆聚合酶链反应 (PCR)扩增产物的简便方法。方法 用PCR方法分别特异性扩增Wilms瘤基因wt1和尿激酶受体 (UPAR)基因 ,并利用Taq聚合酶具有的延伸酶活性将扩增产物直接克隆入T -载体 ,EcoRⅠ酶切鉴定阳性重组子。结果 设计的引物可分别扩增wt1基因锌指区 (34 3bp)和UPAR基因编码区全长 (10 83bp) ;未经修饰的常规PCR和高保真PCR扩增产物可被直接克隆入pGEM -TEasy载体 ,其中正确重组率为 6 2 .5 %～ 87.5 % ;克隆的wt1基因和UPAR基因已被成功用于竞争性PCR或表达。结论 T -载体法是克隆PCR产物通用而有效的方法。

多药耐药基因MDR1的转移与表达研究

为建立逆转录病毒介导的多药耐药基因MDR1转移体系，用脂质体转染法将复制缺陷型道病毒载体HaMDR导入鼠源单向型包装细胞GP＋E86；收集单向型逆病毒上清并重复转导双嗜型包装细胞，获得高满度病毒生产细胞PA317／HaMDR。结果：鼠源单向型与双嗜型病毒生产细胞的滴度分别为6．2×105CF/ml和8．5×105CFU／ml，无辅助病毒产生；聚合酶链反应分析证实两种生产细胞均整合有MDR1基因并能持续表达mRNA；流式细胞术与MTT法显示，转移有MDR1基因的包装细胞可高效表达功能性P一糖蛋白，使耐药水平较母株提高12－198倍。该研究为将MDR1基因导入造血于细胞莫定了基础。

以绿色荧光蛋白为标志研究对肿瘤细胞的基因转移

目的 建立以增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)示踪肿瘤细胞的方法。方法 用编码EGFP的逆转录病毒分别转导人白血病细胞K5 6 2、乳腺癌细胞MCF7和膀胱癌细胞 5 6 37,G418选择获得EGFP标记的肿瘤细胞。EGFP基因的整合与表达分别用聚合酶链反应 (PCR)、流式细胞术(FCM)及荧光显微镜分析。结果 EGFP病毒转导的 3种肿瘤细胞内均有EGFP基因和NeoR基因的整合 ;与对照细胞相比 ,EGFP病毒转导可使EGFP阳性细胞的比例提高到 85 5 %～ 90 0 %。结论 携带EGFP基因的逆转录病毒载体能在肿瘤细胞稳定表达 ,可用于研究肿瘤细胞的生长。

含内部核糖体进入位点的逆转录病毒载体介导多药耐药基因的高效表达

为研究内部核糖体进入位点(IRES)引导多药耐药基因(MDR1)的表达效率，利用pSXLC／pHa载体系统构建双顺反予载体pHa-IRES-MDR1(HaiMDR)。其中的MDR1基因翻译由脑心肌炎病毒IRES控制。通过脂质体法将载体HaiMDR转染入单嗜性包装细胞GP+E86而得到滴度2．0×10^5CFU／ml的病毒；用单嗜性病毒重复感染GP+env Am12细胞获得滴度约6．5×10^5CFU／ml的双嗜性病毒生产细胞，并命名为Am12／HaiMDR。两种病毒生产细胞均具经典MDR表型，与未转染的细胞相比，两者对长春新碱、柔红霉素和紫杉醇产生15—358倍耐药。采用聚合酶链反应，在两种生产细胞均证实有外源性MDR1基因的整合和转录。但同时也发现有异常剪接的转录本存在。利用P-糖蛋白(P-gp)特异性单克隆抗体UIC2结合流式细胞术分析。两种耐药细胞均表达高水平的P-gp。因而，MDR1基因可在IRES控制下以帽非依赖性方式进行有效表达，其在基因治疗研究中可有两种用途：在癌症患者化疗后用于保护干／祖细胞，或在双顺反子载体中作为体内显性选择性标志用于共表达治疗性基因。

包装细胞转导提高逆转录病毒滴度的研究

将含标志基因NeoR的逆转录病毒载体pLXSN用脂质体转染法导入包装细胞，然后利用宿生范围不同的包装细胞（PA317／GP＋envAm12与GP＋E86）相互转导来提高病毒滴度，并用敏感方法检测其安全性。结果显示脂质体DOSPER转染法获得生产细胞的病毒滴度为（2．0～8．0）×105CFU／ml，而病毒相互转导方法则为（2．8～16）×106CFU／ml，可提高滴度达10倍以上；以NIH3T3细胞为靶细胞证实NeoR基因可被重组病毒转移至靶细胞基因组，巢式PCR与标志基因补救分析均未能检测到野生型辅助病毒。提示“乒乓效应”为提高病毒滴度的有效方法且无辅助病毒产生，因而该基因转移系统是安全的。

逆转录病毒介导耐药基因的高效表达

目的 建立多药耐药基因MDR1的逆转录病毒转移系统。方法 脂质体转染法将携带MDR1基因的逆转录病毒载体HaMDR导入单向型包装细胞GP +E86 ;用获得的单向型病毒重复转导双嗜型包装细胞GP +envAm12 ,经秋水仙碱加压选择获得高滴度的病毒生产细胞Am12 /HaM DR ;MDR1基因的转移和表达用聚合酶链反应 (PCR)、MTT比色法和流式细胞术 (FCM )分析。结果 单向型与双嗜型病毒生产细胞的滴度分别为 6 2× 10 5和 9 0× 10 5CFU/ml;PCR分析证实生产细胞有MDR1基因整合并稳定表达 ,但同时存在异常剪接的转录本 ;MTT比色法和FCM分析显示MDR1基因转移细胞的耐药程度提高 12～ 2 6 7倍 ,P 糖蛋白表达率达 97%～ 99%。结论 逆转录病毒可有效介导MDR1基因转移和表达 ,为导入造血干 /祖细胞后进行根治性化疗奠定基础。

血管内皮生长因子基因在正常造血细胞中的表达

目的 探讨正常造血细胞中血管内皮生长因子 (VEGF)基因的表达水平。方法 TRIzol一步法提取正常外周血和非恶性骨髓标本单个核细胞及正常血小板的总RNA ;以 β2 -微球蛋白基因为内对照 ,逆转录聚合酶链反应 (RT -PCR)半定量分析VEGF基因的表达。结果 2 2份外周血标本有 18份表达VEGF基因 ,表达率为81.8% ,其中 8份为中度表达 ;18份骨髓标本VEGF基因的表达率高达 94.4% (17/ 18) ,其中高度表达和中度表达分别为 5份与 6份 ;血小板有VEGF基因的低度表达。结论 正常造血细胞可表达VEGF基因 。

逆转录病毒载体介导的标志基因转移研究

目的：为建立高效、安全的逆转录病毒介导的基因标记系统。方法：用脂质体方法将含有标志基因 Ｎｅｏ Ｒ的逆转录病毒载体 Ｌ Ｘ Ｓ Ｎ 导入包装细胞 Ｐ Ａ３１７ ；通过与单向型包装细胞 Ｇ Ｐ Ｅ８６ 相互转导，获得高滴度的双嗜型产病毒细胞，并以其对人类白血病细胞进行基因标记。结果：脂质体转染法获得的病毒滴度约为２ ．０ ×１０５ Ｃ Ｆ Ｕ／ ｍｌ，而与 Ｇ Ｐ＋ Ｅ８６ 细胞转导后可提高至２ ．８ ×１０６ Ｃ Ｆ Ｕ／ ｍｌ；重组病毒转导白血病细胞（ Ｈ Ｌ－ ６０ ， Ｋ５６２ ， Ｋ Ｇ－ １） 后，聚合酶链反应（ Ｐ Ｃ Ｒ） 证实 Ｎｅｏ Ｒ 基因整合到靶细胞基因组，巢式 Ｐ Ｃ Ｒ 与补救分析均未能检测到辅助病毒。结论：“乒乓效应”可显著提高逆转录病毒滴度，而逆转录病毒介导的基因标记系统是安全的。

TYXN-91型智能血液凝集仪的初步评价

对TYXN—91型智能血液凝集仪PCG功能进行初步评价，结果显示其重复性高（CV＝1．1％～4．2％），稳定性好（KPTT值7小时内波动—0．4～1．7秒），能自动校正试剂活力对结果影响（P＜0．05），血浆内血小板对结果影响小（P＞0.20），但温度影响较大（P＜0.001）；仪器较适合于血液学检验，特别对出血性疾病的筛选有价值，并为血液学检验的自动化和标准化提供了工具。

髓细胞白血病的分子遗传学监测

肿瘤发生是多种基因异常的共同结果,因而检测基因改变可用于肿瘤监测。约1/3急性髓细胞白血病(AML)可发生N-ras原癌基因点突变。随着简便、灵敏的半固相微测序法的建立,它将用于监测AML早期复发和定量检测残留白血病细胞;此外,髓细胞白血病患者降钙素基因高甲基化可作为判定疾病进展的分子标记,且特别有助于慢性髓细胞白血病(CML)分期。