猪流行性腹泻病毒非结构蛋白NSP15抑制细胞焦亡的分子机制研究

为探究猪流行性腹泻病毒(PEDV)及其NSP15蛋白对细胞焦亡的影响及初步的分子作用机制,本研究将表达pGSDMD-p30的质粒转染猪小肠上皮细胞(IPEC-J2细胞),24 h后将PEDV感染该细胞,于感染后12 h和24 h分别收集细胞上清液和细胞,采用LDH试剂盒测定各时间点细胞上清中乳酸脱氢酶(LDH)的释放比例;采用qPCR检测细胞中GSDMD mRNA的转录水平。结果显示,各时间点,转染表达pGSDMD-p30质粒的IPEC-J2细胞中LDH的释放比例均极显著升高,表明细胞发生焦亡,且与转染p GSDMD-p30质粒的细胞相比,PEDV感染的细胞中LDH的释放比例及GSDMD mRNA的转录水平均极显著降低。将表达pGSDMD-p30的质粒分别与不同剂量的PEDV-NSP15质粒共转染HEK293T细胞(pGSDMD-p30+NSP15组);将表达Caspase-1、pGSDMD和表达NSP15的质粒分别共转染HEK293T和IPEC-J2细胞(Caspase-1+pGSDMD+NSP15组)。上述细胞于24 h后均测定各组细胞上清液中LDH的释放比例。结果显示,与pGSDMD-p30组(共转染表达pGSDMD-p30与空载体的细胞)相比,pGSDMD-p30+NSP15组HEK293T细胞及IPEC-J2细胞中LDH的释放比例均显著降低;与Caspase-1+pGSDMD对照组细胞相比,Caspase-1+pGSDMD+NSP15组细胞中LDH的释放比例极显著降低。上述结果表明,NSP15在不同细胞中均可以抑制GSDMD-p30及GSDMD+Caspase-1两种方式引起的细胞焦亡,提示PEDV可能通过NSP15抑制细胞的焦亡。将自噬抑制剂3-MA和蛋白酶体途径抑制剂MG132分别加入不同剂量的NSP15质粒与MYC-pGSDMD质粒共转染的HEK293T细胞中,6 h后采用western blot检测细胞中GSDMD的表达水平;将上述质粒共转染HEK293T细胞,24 h后通过qPCR检测细胞中GSDMD mRNA的转录水平。结果显示,随着NSP15转染剂量的增加,细胞中GSDMD的表达水平逐渐减少,加入3-MA和MG132并不影响GSDMD的表达水平;相比于共转染空载体和NSP15质粒的对照组,MYC-pGSDMD+NSP15组细胞中GSDMD mRNA的转录水平极显著降低。上述结果表明,PEDV NSP15降解GSDMD的过程不是通过自噬和蛋白酶体途径实现的。将4个核酸内切酶活性位点突变的NSP15质粒分别与pGSDMD-p30或pGSDMD质粒共转染HEK293T细胞,24 h后采用LDH试剂盒测定各组细胞上清中LDH的释放比例;采用western blot检测各组细胞中GSDMD的表达水平。结果显示,与p30组相比,H^(226)、H^(241)和K^(282)突变组细胞上清中LDH的释放比例均无显著变化,而D^(265)突变组细胞上清中LDH的释放比例极显著降低;H^(226)、H^(241)和K^(282)突变组细胞中GSDMD的表达水平与阴性对照组细胞中GSDMD的表达水平相当,而D^(265)突变组细胞中GSDMD的表达水平明显减少。上述结果表明,PEDV通过其NSP15蛋白抑制各种细胞的细胞焦亡,且本研究首次证明该蛋白通过其核酸内切酶活性位点H^(226)、H^(241)和K^(282)降解GSDMD并抑制细胞焦亡,为PED的治疗和开发抗PED的药物提供参考。

北大西洋地区气候准20年周期的观测和模拟分析

北大西洋地区除了存在约70 a周期的AMO(Atlantic Multidecadal Oscillation,北大西洋年代际振荡)之外,历史长期气候记录中英格兰温度(Central England Temperature,CET)与格陵兰冰芯净雪累计率还存在显著的20 a周期波动。本研究利用CCSM4(Community Climate System Model version 4)耦合模式工业革命前控制试验(piControl)结果中的海表面温度(Sea Surface Temperature,SST),通过10~50 a带通滤波与扩展经验正交函数(Extended Empirical Orthogonal Function,EEOF)分解,得到在北大西洋副极地海区存在准20 a振荡的逆时针旋转模态。此周期与其临近地区的CET、格陵兰冰芯净雪累计率的准20 a振荡周期相吻合,说明这种北大西洋副极地海区准20 a振荡的海洋模态与其临近地区的大气准20 a振荡之间可能存在相应的联系。进一步利用CAM4(the Community Atmosphere Model version4)大气模式,以北大西洋副极地海区准20 a振荡SST旋转模态为强迫场进行敏感性试验,进一步验证了这种联系。

非经典细胞焦亡体外模型的构建

旨在深入研究非经典细胞焦亡的激活机制,本研究在体外构建非经典细胞焦亡模型,利用PCR方法扩增人源目的基因Caspase-4、hGSDMD-FL和hGSDMD-p30,使用无缝克隆的方法连接到相应的载体中,构建重组真核表达质粒pCMV-MYC-Caspase-4、p3XFLAG-hGSDMD-FL和pcDNA3.1-hGSDMD-p30-MYC,利用VigoFect试剂转染到HEK293T细胞后,采用Western blot方法验证各蛋白的表达情况;通过质粒共转染的方法构建非经典的细胞焦亡模型,分别检测细胞上清中LDH的释放、GSDMD有无被切割为有活性的N端p30片段和荧光观察PI染色情况来确定非经典细胞焦亡模型是否构建成功。结果显示:pCMV-MYC-Caspase-4、p3XFLAG-hGSDMD-FL重组质粒均成功构建,各蛋白于HEK293T细胞内均成功表达,质粒共转染后LDH分泌显著升高,Caspase-4将GSDMD全长片段切割为有活性N端GSDMD-p30片段,荧光显微镜观察到明显的PI染色,表明非经典细胞焦亡模型体外构建成功。非经典细胞焦亡模型在体外的成功构建,为进一步研究其激活机制奠定了基础。

西安市师范类高校与基础教育合作的有效途径研究

当前,高校与基础教育合作的重点多集中于两者的合作办学、高校附属中小学的集团化办学、高校教师教育与基础教育合作模式等方面的研究与实践。本文探索在西安市政府教育主管部门的主导下,形成师范类高校与基础教育学校参与的“校–官–校”合作共赢有效途径,以提高西安市师范类高校与相关中小学协同发展的有效途径,实现西安市基础教育和师范类高等教育的合作双赢。

2019年7月6—7日都兰地区强降水过程分析

利用NCEP 1°×1°再分析资料、卫星云图资料及Micaps常规天气观测资料,采用天气学原理和天气学诊断分析方法,分析和总结2019年7月6—7日都兰地区强降水天气。结果表明:(1)高压后部的低压槽与甘肃北部的低涡配合,造成都兰地区此次强降水天气;(2)低压槽后自唐古拉山地区东移北抬的云系也与此次降水过程紧密联系;(3)强垂直运动、深厚的湿层和水汽的强辐合作用对此次降水过程气了至关重要的作用;(4)高层辐散、低层辐合是产生降水的有利动力条件;(5)夏季θse>71℃并存在高能舌时,可作为都兰地区强降水的一个预报指标。

经典途径细胞焦亡模型的构建

细胞焦亡是一种具有促炎性的细胞程序性死亡过程,可分为依赖Caspase-1的经典途径和依赖Caspase-4/5/11的非经典途径,广泛参与肿瘤、感染性疾病、代谢性疾病等疾病的发生与发展。为构建经典途径细胞焦亡的体外模型,通过PCR扩增目的基因Pro-Caspase-1、H-GSDMD-FL和H-GSDMD-P30,分别连接到相应的载体中,构建重组真核表达质粒p3×FLAG-CMV-Caspase-1、Myc-CMV-hGSDMD-FL和pcDNA3.1-Myc-hGSDMD-p30。利用Lipo8000^(TM)试剂将重组质粒转染到HEK293T细胞中,通过Western blot方法验证蛋白表达情况;进一步将质粒共转染至HEK293T细胞24 h后,检测上清中LDH释放情况,提取蛋白后通过Western blot方法验证蛋白表达及切割情况,并且进行PI染色观察细胞膜破坏情况,验证经典途径的细胞焦亡体外模型是否成功构建。结果显示,重组真核表达质粒均成功构建,p3×FLAG-CMV-Caspase-1和Myc-CMV-hGSDMD-FL可在HEK293T细胞中成功表达。质粒共转染后Western blot检测到GSDMD-FL被Caspase-1切割,切割条带与GSDMD-p30大小相符,上清中LDH水平明显升高,与GSDMD-p30单独转染结果相似,PI染色结果也与上述情况一致,表明HEK293T细胞中经典途径细胞焦亡模型的成功构建,为进一步探究焦亡激活机制以及开发相关药物提供了体外模型。

班溪漂流

假期.爸爸妈妈带我去奉化班溪漂流了一次。早上八点半,我们乘车从宁波出发。到了那儿,我的眼前一亮,只见一条清澈的小溪在乱石中欢快地跳跃着,翻腾出洁白的水花,弹出动人的曲调,像一首欢迎我们的交响曲。