基于LC-MS/MS技术的武平紫灵芝子实体化学成分分析

采用药典规定方法、测定试剂盒及LC-MS/MS方法对武平紫灵芝各类化学成分的组成及含量进行分析,结果表明:与同样来源赤灵芝相比,紫灵芝的灵芝多糖、总黄酮和总氨基酸含量更高,三萜酸含量较低。两者的化学组成成分相似,其主要三萜为灵芝酸B和灵芝酸C,灵芝酸A含量显著低于赤灵芝(P<0.05);多糖主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖和岩藻糖组成,其中甘露糖、阿拉伯糖含量显著高于赤灵芝(P<0.05)。黄酮类中含有柚皮素、黄豆黄苷、山奈酚、表儿茶素、甘草素等成分,其中柚皮素和表儿茶素L含量显著高于赤灵芝(P<0.05)。氨基酸含量组成无显著差异(P>0.05)。LC-MS/MS分析表明,与同样来源赤灵芝相比,紫灵芝三萜类含量增加最多的是2,2'-脱水尿苷和刺囊酸,降低最多的是灵芝酸A;糖类增加最多的是阿拉伯糖,降低最多的是岩藻糖;黄酮类增加最多的是柚皮苷,降低最多的是山奈酚;氨基酸增加最多的是丙氨酸,未有差异2倍以上含量降低的氨基酸。

大刺鳅生长分化因子2(GDF2)基因克隆及表达分析

研究大刺鳅生长分化因子2(growth differentiation factor 2,GDF2)基因与大刺鳅生长发育之间的关系。利用RT-PCR对大刺鳅生长发育相关基因GDF2进行了克隆并对其进行生物信息学分析;通过实时荧光定量PCR研究大刺鳅GDF2基因在肝、性腺、脑等9种组织中的表达情况;通过注射促黄体素释放激素(LHRH-A2)、绒毛膜促性腺激素(HCG)以及地欧酮(DOM)三种激素,研究大刺鳅GDF2基因在肝组织中表达量的变化。结果表明:大刺鳅GDF2基因cDNA长2053 bp,其中5’非编码区序列长145 bp,3’非编码区序列长645 bp,编码区(ORF)序列长1263 bp,编码420个氨基酸的多肽序列,通过生物信息学分析得出GDF2蛋白属于膜外蛋白,蛋白预测理论等电点(p I)为5.38,分子量(Mw)为47.97 kDa,存在潜在N-糖基化位点5个,在线分析软件预测GDF2氨基酸序列N端为信号肽序列。系统进化树分析表明,大刺鳅GDF2与黄鳝GDF2聚为一支,亲缘关系最为接近。实时荧光定量PCR结果显示GDF2基因在肝组织中表达量最高,其次为心、鳃、肠、脾,在脑组织中的表达量最低。LHRH-A2、DOM、HCG三种外源激素注射后,对大刺鳅GDF2 mRNA在肝组织中表达均具有一定的促进作用。研究结果表明GDF2基因主要参与大刺鳅的肝脏组织生长发育调控,基因表达量还受不同类型催产激素的诱导的影响。

拟穴青蟹MnSOD基因的克隆及表达分析

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)可清除生物体内超氧阴离子自由基,有效地预防氧自由基对有机体的伤害。本研究从拟穴青蟹(Scylla paramamosain)的性腺中克隆了两种SOD基因的全长cDNA,分别为线粒体型锰型超氧化物歧化酶基因(SpmtMnSOD)和细胞质型锰型超氧化物歧化酶基因(SpcytMnSOD)。SpmtMnSOD基因cDNA全长1 154 bp,编码218个氨基酸,含有16个氨基酸的靶向线粒体的信号肽;SpcytMnSOD基因cDNA全长1 184 bp,编码286个氨基酸,未发现信号肽序列。两种MnSOD均含有锰型SOD的标签序列,以及4个保守的锰离子结合位点。荧光定量PCR分析显示SpmtMnSOD和SpcytMnSOD均主要在代谢活跃或参与免疫的心脏、鳃、卵巢和肝胰腺等器官中表达;均在卵巢O6期(完全成熟期)显著高于其他卵巢发育阶段,在精巢发育过程中表达量低,且没有显著性差异,推测其主要参与卵巢成熟过程自由基的清除。在副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)感染后,SpmtMnSOD的表达量在鳃中(12 h)有所增加(P<0.05),SpcytMnSOD的表达量在肝胰腺(12 h)和鳃(3、12 h)中显著升高(P<0.05);在肽聚糖(peptidoglycan, PGN)刺激后,SpmtMnSOD的表达量在肝胰腺中(3、6、12 h)显著上升(P<0.05),SpcytMnSOD的表达量在肝胰腺(3、6、12 h)、鳃(6、24 h)和血(6、12 h)中均显著上调(P<0.05);在聚肌苷酸胞苷酸(polyinosinic:polycytidylic acid, Poly I:C)刺激后,SpmtMnSOD的表达量在肝胰腺(6、12 h)、鳃和血(3、6 h)中均显著增加(P<0.05),SpcytMnSOD的表达量在肝胰腺(12 h)、鳃(6、12 h)和血(3、6 h)中均显著增加(P<0.05)。推测这两种SOD参与了青蟹对外界环境的应激反应,对青蟹清除免疫应激产生的自由基起重要作用。

斑节对虾细胞周期蛋白E基因的克隆与表达分析

为了解细胞周期蛋白E(cyclin E)基因在斑节对虾(Penaeus monodon)发育过程中的作用,构建和测序了斑节对虾全组织cDNA文库,获得了斑节对虾细胞周期蛋白(Pmcyclin)E的部分表达序列。通过RACE技术克隆得到1条全长1 706 bp的cDNA序列。Pmcyclin E开放阅读框(ORF)为1 263 bp,编码420个氨基酸。生物信息学分析表明,该氨基酸序列含有周期蛋白家族特有的CYCLIN保守区并含有N-糖基化位点及磷酸化位点。经BLAST同源性分析表明,该基因编码蛋白与红火蚁(Solenopsis invicta)、切叶蜂(Megachile rotundata)等多种节肢动物细胞周期蛋白E有很高的同源性。组织分布分析表明,该基因在斑节对虾精巢、卵巢、肠、脑、肝胰腺、胃和心脏组织中均有表达,其中卵巢中表达量较高,而心脏、胃及肝胰腺中表达量相对较低。分别对蜕皮抑制激素(MIH)注射和眼柄切除的对虾进行表达分析,发现眼柄切除后,Pmcyclin E大量表达,而注射MIH后细胞Pmcyclin E的表达量相对降低。结果表明,细胞cyclin E基因在斑节对虾卵巢发育过程中起重要作用,且眼柄切除对细胞cyclin E的表达具有影响,该结果为进一步探究斑节对虾卵巢的发育机理提供了理论依据。

斑节对虾过氧化氢酶基因全长cDNA克隆及表达分析

过氧化氢酶(catalase,CAT)是一种重要的抗氧化酶,防止过氧化氢对机体的氧化应激。该研究以斑节对虾(Penaeus monodon)肝胰腺转录组中筛选获得的CAT基因片段为基础,利用RACE技术获得斑节对虾CAT基因(Pm CAT)cDNA全长。该基因cDNA全长为1 909 bp,开放阅读框为1563bp,编码520个氨基酸。PmCAT推导的氨基酸序列与其他动物氨基酸序列具有高度的一致性。实时定量PCR结果显示,PmCAT基因在斑节对虾的不同组织中均有表达,其中在鳃的表达量最高,肝胰腺和胸神经次之。在硫酸铜(CuSO_4)胁迫下,PmCAT基因在肝胰腺中的表达量显著下调(P<0.05),在第24和第48小时恢复正常表达量;在pH 7.0胁迫下,PmCAT表达量在第12小时升高达最大值(P<0.05),然后恢复到正常水平;在pH 9.0胁迫下,PmCAT基因表达显著低于正常组(P<0.05)。研究表明,PmCAT基因参与斑节对虾氧化应激和对环境毒理的适应性反应。

斑节对虾细胞周期蛋白Y基因克隆与原核表达

为了研究细胞周期蛋白Y（cyclin Y）在斑节对虾（Penaeus monodon）卵巢发育中的作用,从斑节对虾转录组数据中筛选获得cyclin Y基因部分序列,采用SMART-RACE方法克隆得到斑节对虾细胞周期蛋白Y （Pm-cyclin Y）基因cDNA全序列。Pm-cyclin Y基因cDNA全长1576 bp,其中包含108 bp的5′非编码区（5′UTR）和439 bp的3′非编码区（3′UTR）以及1029 bp的开放阅读框（ORF）,可编码342个氨基酸。生物信息学分析显示,其编码的氨基酸序列有1个保守的周期蛋白框（cyclin box）同源结构域（172~257 aa）,预测的分子量约为37.6 kD,理论等电点6.64。实时定量 PCR 显示其 mRNA 在卵巢的表达量显著高于其他组织（P〈0.05）；并且在卵巢5个不同发育期都有表达,在III期卵巢中的表达量最高。本研究通过原核表达方法对Pm-cyclin Y进行重组表达,为其蛋白质功能方面的研究奠定了基础。

斑节对虾组织蛋白酶L基因的克隆及其表达分析

通过克隆得到斑节对虾(Penaeus monodon)组织蛋白酶L基因(PmCatL)cDNA全长。该基因序列全长1 850bp,包括1 026 bp的开放阅读框,编码341个氨基酸。预测的PmCatL蛋白由信号肽(Met^1-Ala^(18))、前体域(Val^(19)-Gln^(123))和成熟域(Leu^(124)-Val^(341))三部分构成,存在3个半胱氨酸蛋白酶活性位点(Cys^(148)、His^(287)、Asn^(308))和1个潜在的糖基化位点(Asn^(99))。具有组织蛋白酶L的E^(45)X_3RX_3FX_2NX_3IX_3N^(64)和G^(187)CXGG^(192)保守序列。同源性分析显示,PmCatL氨基酸序列与其他物种相似性为36%~75%。进化树显示PmCatL和罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)亲缘关系最近,并与其他无脊椎动物的组织蛋白酶L聚成一支。表达结果表明,PmCatL基因在肝胰腺、淋巴、肌肉、性腺等被测组织中均有表达,其中淋巴和肝胰腺的表达量较高;PmCatL基因在斑节对虾仔虾时期表达量较高,可能与斑节对虾在这一时期的生长发育相关;PmCatL在卵巢发育的Ⅳ期表达量最高,可能在斑节对虾的卵巢发育中发挥重要作用。

斑节对虾泛素结合酶PmUbc基因的克隆及表达分析

以从斑节对虾(Penaeus monodon)肝胰腺转录组数据中筛选的泛素结合酶(Ubiquitin-conjugating enzyme,Pm Ubc)基因片段为基础,利用SMART-RACE技术获得Pm Ubc的c DNA全长,并利用生物信息学对其进行了分析。Pm Ubc基因c DNA全长598 bp,包括编码154个氨基酸的465 bp的开放阅读框(ORF)、17 bp的5'非编码区(UTR)和116 bp的3'UTR。Blast分析显示,Pm Ubc与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)等物种的Ubc具有较高的同源性。利用实时荧光定量PCR技术研究了Pm Ubc mRNA在不同组织和卵巢发育各时期的相对表达量和变化模式。结果表明,Pm Ubc mRNA在斑节对虾的脑、胸神经、心脏、肝胰腺、卵巢、肌肉、血淋巴中均有表达;Pm Ubc基因在卵巢发育Ⅲ期表达量最高,其次是Ⅰ和Ⅳ期。结果显示,Pm Ubc基因在斑节对虾卵巢发育过程中可能具有重要的作用,该实验结果为斑节对虾卵巢发育调控的分子机制研究提供一定的理论依据。

斑节对虾血淋巴低丰度蛋白双向电泳技术体系的优化

文章探索并优化了斑节对虾（Penaeus monodon）血淋巴双向电泳技术体系，对斑节对虾血淋巴总蛋白抽提方法进行优化，减小高丰度蛋白的影响；对双向电泳过程各步骤，如IPG胶条pH范围的选择、等电聚焦程序、上样量等进行了优化，得到高分辨率的2-DE图谱，用PDQuest软件进行了初步分析。结果表明，用PEG 6000能更快捷有效地去除血淋巴中的高丰度蛋白，增加低丰度蛋白的点数及浓度；在抽提蛋白过程中，利用预冷的80%丙酮洗涤，在一向电泳过程中设置100 V低压除盐，能更有效地去除蛋白中的盐分；采用18 cm、pH 3~10 NL 的中型胶条，能更好地显示低丰度蛋白点的分布；被动水化上样300 μg结合硝酸银染色方法，能有效提高双向电泳图谱中蛋白点的分离度和分辨率。该试验为斑节对虾及其他甲壳动物血淋巴蛋白质组学相关研究提供了稳定可重复的研究方法。

斑节对虾GTF2H4基因的分子克隆及表达分析

基础转录因子IIH亚基4（generaltranscriptionfactorIIHsubunit4，GTF2H4）作为基础转录因子IIH（TFI—IH）的重要组成成员对真核生物转录过程中所涉及的细胞生长、发育、代谢等具有重要调控作用。该研究以斑节对虾（Penaeusmonodor）为研究对象，利用eDNA末端快速扩增技术（rapidamplicationofeDNAends，RACE）获得了PmGTF2H4基因的cDNA全长。该序列全长1401bp，可编码466个氨基酸，其中包括108bp的5’非编码区域（UTR）和372bp的3’UTR。同源性分析显示，PmGTF2H4与阿里山潜蝇茧蜂（Fopiusarsanus）等物种的GTF2H4具有较高的同源性。荧光定量PCR（qRT—PCR）结果表明，PmGTF2H4在斑节对虾卵巢中的表达量显著高于其他组织；在卵巢的5个不同发育时期中，PmGTF2H4在V期的表达量最高，在I期的表达量最低。注射五羟色胺（5-HT）后发现PmGTF2H4的表达水平在6～48h显著上调。通过上述研究结果可以预测PmGTF2H4基因参与了斑节对虾卵巢的发育，并起了一定的作用。

斑节对虾泛素融合蛋白UbL40基因的克隆及表达分析

从斑节对虾（Penaeus monodon）肝胰腺转录组数据中筛选获得泛素融合蛋白Ub L40基因（ubiquitin/ribosomal L40 fusion protein,Pm Ub L40）的部分序列,利用RACE技术克隆其c DNA全长序列,通过生物信息学进行结构分析;利用实时定量PCR技术检测该基因在斑节对虾不同组织及卵巢不同发育期的表达情况。结果表明,Pm Ub L40基因c DNA全长571 bp,开放阅读框（Open reading frame,ORF）长390 bp,编码129个氨基酸,预测分子量约14.7 ku,理论等电点为9.76。预测氨基酸序列的N-末端（1～76aa）为高度保守的泛素结构域,C-末端（77～129aa）为典型的核糖体蛋白L40结构域。多重序列比对表明不同物种的Ub L40在进化过程中高度保守。实时定量PCR结果显示Pm Ub L40基因在肝胰腺的表达量最高,肌肉、卵巢次之,其他组织的表达较低;在卵巢发育过程中Pm Ub L40基因在II期表达最高,其次是V期,显著高于I、III、IV期。研究结果表明Pm Ub L40基因在斑节对虾卵巢发育过程中可能具有重要作用。

斑节对虾CDK2基因全长cDNA克隆及表达分析

该研究以斑节对虾(Penaeus monodon)c DNA文库中的CDK2片段为基础,利用RACE技术获得Pm CDK2的c DNA全长,并利用生物信息学对其进行了分析。Pm CDK2基因全长1 679 bp,包括编码306个氨基酸的921 bp的开放阅读框(ORF),258 bp的5'UTR和500 bp的3'UTR。同源性分析显示,Pm CDK2与罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)等物种的CDK2具有较高的同源性。使用荧光定量PCR技术研究了Pm CDK2的mRNA在不同组织和卵巢发育各时期的相对表达量和变化模式,结果显示,Pm CDK2在斑节对虾的脑、心、淋巴、肝胰腺、性腺等组织中均有表达,其中精巢中表达量显著高于其他组织;卵巢发育阶段表达分析则显示Pm CDK2在Ⅲ期表达量最高,其次是Ⅳ期。通过原核表达技术成功获得了含有6个His标签的融合蛋白,并对融合蛋白进行Western Blot试验,初步探讨了重组蛋白表达情况。结果表明,Pm CDK2基因在斑节对虾卵巢发育过程中可能发挥了重要作用,该结果对进一步探究斑节对虾卵巢发育机理提供了一定的理论依据。

斑节对虾GRP94基因的克隆及其在不同应激条件下的表达与分析

以斑节对虾(Penaeus monodon)为研究对象,利用RACE技术克隆得到了斑节对虾Pm GRP94基因c DNA全长,并对其结构进行生物信息学分析。Pm GRP94全长2 990 bp,包括75 bp的5'UTR、527 bp的3'UTR和2 388bp的ORF。利用实时定量PCR技术,对Pm GRP94组织特异性及其在不同p H、盐度和3种重金属应激下转录水平变化情况及特点进行了研究。结果显示,Pm GRP94基因存在组织特异性,并在肝胰腺中的表达量最高;不同的应激条件下其表达具有明显差异,其中在p H、铜(Cu)和锌(Zn)的应激下Pm GRP94的表达显著升高。因此预测该基因可以作为斑节对虾受p H、Cu和Zn胁迫的指示基因。

拟穴青蟹PHGPx基因的克隆及其表达分析

为了探讨磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase,PHGPx)在拟穴青蟹免疫防御反应和精巢发育中的作用,实验从拟穴青蟹转录组数据库中筛选出PHGPx基因的EST序列,利用SM ART-RACE技术克隆得到该基因的全长cDNA,命名为SpPHGPx。通过相关生物信息学软件对该序列进行分析,运用实时荧光定量技术对Sp-PHGPx mRNA在成熟雌雄拟穴青蟹各组织、性腺不同发育时期以及H2O2和脂多糖(LPS)应激下鳃和肝胰腺组织中的表达情况进行分析。结果发现,Sp-PHGPx基因的cDNA全长为1 024 bp,编码180个氨基酸。同源性分析和系统进化树分析表明,Sp-PHGPx与其他物种的PHGPx(GPx4)亲缘关系较近。实时定量PCR结果显示,Sp-PHGPx在成熟拟穴青蟹雌雄各组织中均有不同程度的表达,其中精巢的表达量最高。在性腺不同发育阶段,Sp-PHGPx在卵巢发育过程中的表达量差异不显著;而在精巢发育过程中,其表达量在精子细胞期(T2期)显著高于精母细胞期(T1期)和成熟精子期(T3期),同时也显著高于卵巢发育各时期的表达量。在LPS应激下,鳃和肝胰腺中Sp-PHGPx的表达量分别在6和12 h显著上调;H2O2应激下,鳃中的表达量在3 h显著升高,肝胰腺中的表达量在被检测的各时相中无显著差异。研究表明,Sp-PHGPx可能在免疫防御反应以及精巢的发育和成熟等过程中发挥着重要作用。

斑节对虾UBE2H基因克隆及其表达

【目的】克隆斑节对虾（Penaeusmonodon）泛素结合酶E2 H基因（UBE2H），了解其组织特异性表达情况，为揭示UBE2H在斑节对虾卵巢发育过程的作用提供依据。【方法】PCR扩增斑节对虾UBE2H基因的开放阅读框，利用实时荧光定量PCR检测UBE2H基因在斑节对虾各组织及不同发育期斑节对虾肝胰腺和卵巢中的表达情况；并构建pET32a-UBE2H原核表达重组质粒，进行诱导表达及蛋白纯化。【结果】克隆获得的斑节对虾UBE2H基因全长1010 bp （GenBank登录号KU870456），其中，5＇非编码区77 bp，3＇非编码区378 bp，开放阅读框555 bp（编码184个氨基酸）。斑节对虾UBE2H蛋白等电点（pI）4.88，分子量20.85 kD。斑节对虾UBE2H氨基酸序列与其他物种相似度很高，为78.00%-83.00%。实时荧光定量PCR检测结果显示，UBE2H基因在斑节对虾淋巴组织中表达量最高，其次为鳃；在斑节对虾不同卵巢发育期肝胰腺和卵巢中的表达量均呈先上升后下降的变化趋势，但其峰值出现时间存在差异，肝胰腺的最高表达量出现在卵巢III期，卵巢的最高表达量出现在卵巢II期。经原核表达获得的斑节对虾UBE2H融合蛋白约39.00 kD，纯化后的蛋白浓度为2.92μg/μL。【结论】斑节对虾UBE2H参与了其卵母细胞发育和肝胰腺中卵黄蛋白的转运过程，与斑节对虾的卵巢发育密切相关。

斑节对虾含硒谷胱甘肽过氧化物酶基因全长克隆及表达分析

为了研究含硒谷胱甘肽过氧化物酶(selenium-dependent glutathione peroxidase,SeGPx)在斑节对虾应激反应和卵巢发育中的作用,实验以斑节对虾肝胰腺转录组数据中筛选获得的Se-GPx基因(Pm Se-GPx)片段为基础,利用RACE技术获得Pm Se-GPx基因的c DNA全长,并对其进行了生物信息学分析;利用荧光定量PCR技术研究了Pm Se-GPx在斑节对虾不同组织、卵巢发育各期、肝胰腺组织在pH9、硫酸铜(Cu^(2+))应激下的相对表达量和变化趋势。结果显示,Pm Se-GPx基因c DNA全长为959 bp,5'非编码区(UTR)长10bp,开放阅读框(ORF)长639 bp,编码212个氨基酸,310 bp的3'UTR包含一个硒代半胱氨酸插入序列(SECIS),ORF中的密码子209TGA211编码硒代半胱氨酸(selenocysteine,U67)。实时定量PCR实验结果表明,Pm Se-GPx在斑节对虾的肝胰腺、卵巢、精巢、心脏等组织中均有表达,其中肝胰腺中表达量显著高于其他组织,卵巢次之;卵巢发育阶段表达结果则显示Pm Se-GPx在卵巢发育各期均有表达,在卵巢Ⅲ期表达量最高,其次是V期;在Cu^(2+)胁迫下,其表达量总体呈现先下降后上升然后又下降的趋势;在环境pH为9胁迫下,表达趋势呈现先下降,后回升,然后又下降,再大幅上升的趋势。研究表明,SeGPx在斑节对虾卵巢发育过程中具有重要作用,且Se-GPx参与斑节对虾对环境理化因子应激的免疫调控。

斑节对虾细胞周期蛋白T基因的克隆和表达分析

真核生物的转录调控多发生在转录的延伸阶段,细胞周期蛋白T(cyclin T)是细胞转录的重要调控因子。文章利用RACE技术获得斑节对虾(Penaeus monodon)cyclin T(Pmcyclin T)c DNA全长,其全长为3 421 bp,其中开放阅读框(ORF)3 135 bp,编码1 044个氨基酸;生物信息学分析显示,该氨基酸序列含有一个周期蛋白家族特有的CYCLIN保守区,并含有N-糖基化位点和磷酸化位点;经BLAST同源性分析显示,细胞周期蛋白T编码的蛋白与柑橘木虱(Diaphorina citri)、切叶蚁(Acromyrmex echinatior)等多种节肢动物有很高的同源性;利用qRTPCR技术对Pmcyclin T在不同组织及卵巢发育各时期的mRNA水平的表达谱进行了研究。结果表明,细胞周期蛋白T在斑节对虾的心、卵巢等7个组织中均有表达,其中卵巢中表达量显著高于其他组织(P<0.05);在卵巢发育各时期中,细胞周期蛋白T在Ⅲ期表达量最高。

斑节对虾增殖细胞核抗原基因克隆及表达分析

为研究增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)在斑节对虾(Penaeus monodon)卵巢发育中的功能,利用RACE技术克隆得到了斑节对虾PCNA基因(PmPCNA)的cDNA全长序列。该序列全长978 bp,包括135 bp的5′非编码区(5′UTR)、60 bp的3′UTR和编码260个氨基酸的783 bp的开放阅读框(ORF)。同源性分析结果表明,PmPCNA与其他物种具有很高的蛋白同源性。组织表达模式分析表明,PmPCNA在所监测的各组织中为组成性表达,其中在卵巢和脑中表达量较高;卵巢发育不同阶段基因的表达分析则表明PmPCNA在Ⅲ期表达量最高,是其他各期表达量的2倍;注射五羟色胺(5-hydroxy tryptamine,5-HT)后,PmPCNA在卵巢中表达量明显上升,其中在48 h表达量升高幅度最大,是对照组的5倍左右。利用原核表达技术获得了PCNA的体外重组蛋白,Western Blot分析证实该重组蛋白为PCNA蛋白。以上研究结果表明,PmPCNA蛋白是斑节对虾卵巢发育过程中的重要调节因子,本研究为进一步认识斑节对虾卵巢发育机制提供了基础资料。

斑节对虾cyclinH基因的原核表达和蛋白纯化

cyclin H是细胞分裂周期调控中的重要因子,研究斑节对虾cyclin H对阐明斑节对虾卵巢发育机制有重要意义。构建了斑节对虾cyclin H的重组表达质粒p ET21a/cyclin H,利用原核表达技术进行诱导表达获得目的蛋白,并用亲和层析技术进行纯化,用SDS-PAGE、Western blot和质谱联用分析诱导和纯化结果。结果表明,斑节对虾cyclin H重组蛋白获得了表达,纯化的蛋白经鉴定为cyclin H重组蛋白;在22℃和37℃培养条件下,重组蛋白在LA和YTGA两种培养基上均能被诱导表达;22℃条件下,部分融合蛋白为可溶性表达;在37℃培养条件下LA培养基获得较好的效果,且均以包涵体形式存在。

斑节对虾cyclin G2基因克隆及不同刺激下的表达分析

细胞周期蛋白G2(cyclin G2)是细胞周期中的重要调控因子。该研究初步探讨斑节对虾(Penaeus monodon)细胞周期蛋白G2(Pmcyclin G2)在卵巢发育中的作用,利用RACE技术克隆获得4075bp Pmcyclin G2 c DNA全长,其开放阅读框(ORF)1161bp,编码386个氨基酸。利用荧光定量PCR技术研究了Pmcyclin G2组织表达模式,结果显示,Pmcyclin G2在斑节对虾的心脏、血淋巴、肝胰腺、卵巢等组织中均有表达,其中肌肉中表达量最高;卵巢发育不同阶段Pmcyclin G2的表达分析则表明,Pmcyclin G2在III期表达量最高;注射5-羟色胺(5-HT)能诱导卵巢Pmcyclin G2基因表达升高,多巴胺(DA)则抑制卵巢中Pmcyclin G2基因表达。利用原核表达技术获得了cyclin G2的体外重组蛋白,Western Blot分析证实重组蛋白为cyclin G2蛋白。此结果为进一步研究该蛋白的功能提供了条件。以上研究结果表明,Pmcyclin G2基因可能与斑节对虾卵母细胞发育有密切关系,该结果可为进一步探究斑节对虾卵巢的发育机理提供理论依据。