分泌型磷脂酶A_2cDNA与载体pRc/CMV定向克隆及表达

为了构建分泌型磷脂酶Ａ２（ｓｅｃｒｅｔａｒｙ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２，ｓＰＬＡ２） ｃＤＮＡ的有效表达系统，该文从无效表达的重组体ｓＰＬＡ２ － ｐＧＥＭ７ 中制备ｓＰＬＡ２ 片段，将其插入中间载体ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＢＳＳＫＲ的ＥｃｏＲ１ 位点，利用ｓＰＬＡ２－ ＢＳＳＫ重组体转化ＤＨ１ 感受态细胞，筛选ａｎｔｉｓｅｎｓｅｓＰＬＡ２－ ＢＳＳＫ 重组体，应用Ｘｂａｌ、Ｈｉｎｄ３ 双酶消化该重组体并回收带有不同粘性末端的ｓＰＬＡ２ 片段，因Ｘｂａｌ、Ｈｉｎｄ３ 消化载体ｐＲｃ／ＣＭＶ，使之线性化并带有Ｘｂａｌ、Ｈｉｎｄ３ 的粘性末端。ｓＰＬＡ２ 定向插入ｐＲｃ／ＣＭＶ 载体，构建成具有ＣＭＶ 强启动子的表达系统。重组体转染鼠巨噬细胞，扩增培养，从细胞中提取总ＲＮＡ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ 杂交法检测ｓＰＬＡ２ ｍＲＮＡ。结果表明ｐＲｃ／ＣＭＶ 可以用于ｓＰＬＡ２ 表达及各种因素影响表达的研究。

hTRT反义基因转染对人结肠癌细胞生长的抑制作用

利用基因重组技术,hTRT基因反向插入真核表达载体pcDNA3.0,获得重组体pcDRTRT,通过脂质体法导入人结肠癌细胞株SW-111C,获得稳定转染细胞系,即反义细胞,该细胞易脱落,出现明显生长抑制现象;失去叠落生长能力;流式细胞仪(FCM)证实导入反义hTRT后,G0/1期细胞增加,G,M和S期细胞减少,增殖指数(PI)降低;且不能在软琼脂中形成集落;并发现反义细胞中hTRT表达水平明显下降。说明反义hTRT基因体外导入结肠癌细胞株SW-111C可以明显降低端粒酶活性,抑制结肠癌细胞的生长、增殖且能使其恶性表型发生逆转。

胞内型磷脂酶A2基因亚克隆与基因表达

目的 研究花生四稀酸在细胞中的释放及前列腺素的合成，构建与花生四稀酸释放相关的表达系统。即胞内型磷脂酶Ａ２（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ ｃＰＬＡ２）ｃＤＮＡ－ｐＲＣ／ＣＭＶ。方法 从克隆载体ｐＭＴ２用Ｓａｌ１制备ｃＰＡＬ２ｃＤＮＡ；平末端连接ｃＰＡＬ２－ｐＲＣ／ＣＭＶ；转染鼠巨噬细胞及筛选正向阳性克隆；ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ检测ｃＰＬＡ２ ｃＤＮＡ基因表达。结果

sPLA2cDNA表达载体的选择和亚克隆

目的：选择适当的载体，启动Ｃａ＾２＋依赖分泌型磷脂酶Ａ２（ｓＰＬＡ２）ｃＤＮＡ的表达，为进一步研究各种因素对该酶活性的影响奠定基础。方法：首先从ｓＰＬＡ２－ｐＧＥＭ７重组体（这一重组体不能在转染的真核细胞中表达）获得人ｓＰＬＡ２ｃＤＮＡ，克隆该片断进入中间载体ＢＳＳＫ（使ｓＰＬＡ２ｃＤＮＡ两端出现ＸｂａＩ、Ｈｉｎｄ３酶切位点），选择ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓＰＬＡ２－ＢＳＳＫ重组体进行扩增。

去甲斑蝥素诱导人肝癌细胞凋亡的研究

目的探讨去甲斑蝥素(NCTD)对人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的影响。方法用MTT方法检测人肝癌细胞SMMC-7721的生长抑制率。应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。结果 NCTD对人肝癌细胞SMMC-7721有生长抑制作用,随浓度升高、时间延长作用增强,呈剂量和时间效应关系。流式细胞仪示SMMC-7721细胞的S期细胞明显增多,G0/G1期细胞减少,凋亡率上升(P<0.05或<0.01)。结论 NCTD能显著抑制人肝癌SMMC-7721细胞的生长,其可能与抑制SMMC-7721细胞增殖,诱导细胞凋亡有关。

老年人载脂蛋白E基因多态性的分布状态研究

目的 研究载脂蛋白 E(Apo E)基因多态性在老年人群的分布状态。方法 应用聚合酶链 -限制性片段长度多态性 (PCR- RFLP)方法先扩增出 Apo E基因第 4外显子内的 2 2 7bp片段 ,继以限制性内切酶 Cfo 酶解消化 ,8%聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,最后银染显带判定基因型 ,并计算等位基因频率。结果 本实验共检测了正常汉族老年人 72例并与 88例对照组比较 ,对照组ε2 等位基因频率为 5.7% ,而 71～ 78岁的老年组中ε2 为1 0 .0 %。结论 ε2 等位基因频率随增龄而增高。

Northern杂交法分析转染的胞苷酶

目的：研究人胞苷转移酶（ＣＴ）ｃＤＮＡ在鼠巨噬细胞中的表达。方法：按照Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ等人的方法人转染的巨噬细胞中提取总ＲＮＡ，电泳分离ＲＮＡ，转移ＲＮＡ至尼龙膜并固定，制备３２ｐ标记的胞苷转移酶ＤＮＡ探针，杂交及放射性自显影。结果：对照组无表达，同类转染的细胞均有不同程度的表达。结论：制备探针前应用电泳法确定ＣＴｃＤＮＡ片段的浓度比紫外光吸收法更准确适用。

癫痫发病的免疫炎症机制研究

目的 :建立大鼠的实验性癫痫模型 ,探讨癫痫发病的免疫炎症机制。方法 :用皮下注射海仁酸方法建立实验性癫痫大鼠模型 ;采用结晶紫染色方法观察实验性癫痫大鼠海马神经元的变性 ;采用免疫组织化学染色方法观察实验性癫痫大鼠MHC分子和补体C3b受体的表达。结果 :给大鼠皮下注射海仁酸可成功地建立实验性癫痫大鼠模型 ,其大脑海马锥状细胞层可见到神经元的变性 ,并可见MHC -Ⅰ、MHC -Ⅱ类分子和补体C3b受体的明显表达。结论 :实验性癫痫大鼠大脑海马硬化过程中 ,存在着补体系统参与的免疫反应发生 ,并引起炎症反应。

消炎痛对癫痫保护作用的免疫学研究

目的 评价消炎痛在癫痫神经细胞退行性变中的作用。方法 免疫组化染色。结果 海仁酸诱导的实验性癫痫大鼠海马小胶质细胞表达 MHC- 、MHC- 类分子和 C3 b受体。用消炎痛处理后 ,其表达可明显降低。同时消炎痛还可阻止部分神经元退行性变。结论 消炎痛通过抑制免疫应答对实验性癫痫大鼠海马退行性变具有保护作用。

大鼠肾脏三肽基肽酶Ⅰ物理化学性质和氨基酸顺序分析

为进一步探讨三肽基肽酶Ⅰ(TripeptidylpeptidaseI,TPPI)的物理化性质和酶的动力学特征,通过SP 琼脂糖凝胶(SP sepharose),Phenyl cellulofine,ResorceS,超葡聚糖凝胶(SuperdexG 75)柱层析的方法,提纯大鼠肾脏三肽基肽酶Ⅰ并测定它的分子量、理化性质、酶的动力学参数及N 末端氨基酸顺序.经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定后,得到了单一区带.提纯倍率约为8000倍.用SDS PAGE时,β 巯基乙醇(β ME)不存在和存在下,其分子量为43kD和46kD.用非变性 PAGA时,其分子量为280kD.在pH2.2～10.5范围内,TPPI具有水解Ala Ala Phe MCA的活性.该酶对于Ala Ala Phe MCA的最适pH值为3.5～4.5.在最适pH4.0条件下,对Ala Ala Phe MCA底物的Km、Vmax、Kcat和Kcat Km值分别是:680μmol L,3.7mmol (g·min),33.1 s和4.87×104 (s·mol).TPPI能被对氯汞苯甲酸盐(PCMBS)和HgCl2强烈地抑制,被二异丙基氟磷酸酯(DFP)中等程度地抑制.TPPI是受巯基试剂调节的丝氨酸酶.

E6-AP在前列腺癌LNCaP细胞基因表达调控中的作用

目的:探讨前列腺癌LNCaP细胞中E6相关蛋白(E6-AP)对雄激素受体(AR)和丝苏氨酸激酶(Akt)表达的调节作用,阐明E6-AP的作用机制。方法:应用双稳定表达的人前列腺癌细胞株LNCaP/E6-AP细胞,通过Western blotting分析E6-AP过表达对细胞中AR和Akt蛋白表达水平的影响;利用免疫荧光技术观察E6-AP与AR在细胞中的定位关系。结果:与E6-AP低表达的LNCaP细胞比较,E6-AP过表达的LNCaP细胞中AR蛋白和磷酸化的AR蛋白的表达量明显降低(P<0.05);Akt蛋白和磷酸化的Akt蛋白的表达量明显升高(P<0.01)。免疫荧光法检测结果显示:E6-AP和AR在细胞中定位情况相似。结论:E6-AP过表达可下调AR蛋白和磷酸化AR蛋白的表达,并上调Akt蛋白及磷酸化Akt蛋白的表达,且E6-AP与AR在细胞中定位基本一致,E6-AP可能与前列腺癌的发生和发展密切相关。

活菌作为抗肿瘤制剂和肿瘤基因治疗载体的研究

随着细菌生物学和分子生物学的发展,细菌抗癌治疗的应用更为广泛.其可增加化疗药物的敏感性,增强抗癌药物作用,并作为基因治疗的载体.细菌毒素本身就可以用来攻克肿瘤.而最有应用前景的是,经遗传修饰的细菌作为自杀基因载体选择性地破坏肿瘤细胞,保护正常组织不受损坏.文章就活菌作为抗肿瘤制剂和肿瘤基因治疗载体的研究进展进行综述.

鹿茸等动物生药鉴定方法的研究进展

鹿茸是传统名贵中药材。我国在2010年版《中华人民共和国药典》中规定了梅花鹿茸、马鹿茸为正品药材。由于鹿茸及产品需求量增加,使得伪品、混淆品和代用品在国内的中药源市场屡见不鲜,导致了中药材市场的混乱。这种现象也见于其它名贵中草药材,如人参、鹿鞭、龟甲以及貂心等,严重影响了中国传统药学的美誉,更制约着中国传统医药的规范化、标准化和国际化的发展。因此提供简捷、精准的鉴定方法为净化中药材市场、发扬光大我国的传统中药具有极其深远的意义。

中枢神经系统的免疫学特征

中枢神经系统的免疫“特免状态”和血脑屏障都是相对不完整的。在特定条件下,血脑屏障的通透性发生改变,具有免疫效应的淋巴细胞可以通过血脑屏障。脑内血管周间隙具有类似淋巴管道的作用。脑内多种细胞具有抗原提呈作用。中枢神经系统神经元退行性变过程中表达主要组织相容性复合物分子、黏附分子和补体受体,并产生多种细胞因子,从而引发脑内免疫炎症。

检验医学教育现状与改革

从检验医学教育发展的现状及面临的挑战，提出只有加快检验医学教育改革，才能为社会培养出多层次高质量检验医学人才，以适应社会发展和医学发展需要。

抗多巴胺抗体的制备

多巴胺是人体内重要神经递质,由于其分子量小,结构主体儿茶部分在碱性溶液中和有氧存在时极不稳定,所以制备多巴胺—蛋白质结合物非常困难,而且抗多巴胺抗体特异性不高。本文以Mannich反应并加以改良将多巴胺与载体牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)相连成多巴胺结合物,以此结合物免疫家兔制备抗多巴胺抗体,现报告如下。

E6-AP对前列腺癌细胞株LNCaP细胞增殖和细胞周期的影响

目的:研究E6相关蛋白(E6-AP)对前列腺癌细胞增殖和细胞周期的影响,阐明E6-AP在雄激素受体通路中的作用机制及在前列腺癌发生发展中的作用。方法:采用电穿孔方法制备tTA及E6-AP稳定转染细胞株;利用强力霉素(DOX)的调节作用,通过MTT实验观察E6-AP过表达及低表达对LNCaP细胞增殖的影响;利用流式细胞仪进行PI单染色检测E6-AP过表达及低表达对LNCaP细胞周期进程的影响。结果:成功构建双质粒稳定转染细胞株,与E6-AP低表达的LNCaP细胞和DOX关闭表达后的稳定株比较,E6-AP过表达的LNCaP细胞数目明显增多(P<0.01),且处于S期的细胞比例明显增大(P<0.01)。结论:E6-AP过表达可促进LNCaP细胞增殖并促进细胞进入S期,提示E6-AP与雄激素受体信号通路有密切关联。

骨肉瘤特异生物诊断探针制备

目的构建与骨肉瘤细胞高亲和性与特异性结合的DNA寡核苷酸适配体库,用于骨肉瘤临床特异性诊断。方法体外合成40 nt高通量随机序列的单链DNA寡核苷酸文库(ssDNAs);骨肉瘤细胞(U-2 OS)作为目标细胞与文库ssDNAs反应;指数富集配体的系统进化(SELEX)技术用于筛选富集与靶细胞结合的寡核苷酸;聚合酶链反应(PCR)技术与亲和层析技术用于次轮反应文库的制备;应用荧光光谱跟踪筛选过程;对最后的筛选序列进行克隆、测序与保存。结果十一轮至十三轮筛选后的ssDNAs荧光光谱曲线显示了有意义重叠,因此结束筛选;对十三轮筛选的ssDNAs进行了克隆测序,依据一级结构的同源序列建立了寡核苷酸探针组群。结论应用SELEX技术最终从高通量的随机文库中获得了与U-2 OS具有高度亲和性的寡核苷酸适配体,适配体库的建立不仅仅用于骨肉瘤的特异性诊断,也将为探针-载体-抗肿瘤药物复合体的研制与实施骨肉瘤定向治疗搭建了可行性平台。

端粒酶核酶抑制肿瘤细胞生长的研究

已证明有84．7％的人类恶性肿瘤组织细胞中端粒酶表达异常增高、端粒酶的作用是合成染色体末端端粒重复序列维持染色体稳定及细胞永生化的关键因素．因此，端粒酶在肿瘤发生发展中起重要作用，是目前最广泛的肿瘤标志物．核酶是一种具有内切酶活性的RNA分子,只要满足一定的空间结构就能定点切割RNA底物、切割端粒酶的核酶(简称为端粒酶核酶)主要针对端粒酶的两个亚单位hTR和hTERT抑制两基因的表达，降低端粒酶的活性,抑制肿瘤细胞的生长．

脑内免疫炎症的发生机制

中枢神经系统神经元退行性变过程中表达主要组织相容性分子、黏附分子和补体受体,并产生多种细胞因子,从而引发脑内的免疫炎症反应.