羟喜树碱诱导的人Tenon囊成纤维细胞凋亡及其机制

背景青光眼滤过手术后人Tenon囊成纤维细胞（HTFs）增生是滤过泡功能下降的主要原因，羟喜树碱是诱导肿瘤细胞及多种非肿瘤细胞凋亡的药物。目前已有羟喜树碱诱导成纤维细胞凋亡的相关报道，但其作用机制尚不完全清楚。目的探讨羟喜树碱是否能诱导HTFs凋亡并研究其作用机制。方法取离体〈6h的供体结膜囊组织，以组织块培养法原代培养HTFs，用含质量分数10％胎牛血清（FBS）的DMEM培养基继续传代培养，用波形蛋白及角蛋白对培养的细胞进行鉴定，取3～6代细胞进行实验。分别将0．Ol、0．05、0．10g／L羟喜树碱加入培养基中作用5min，未加入羟喜树碱的细胞作为对照组，采用细胞计数试剂盒-8（CCK8）法检测各组细胞的增生能力并进行比较。用0．10g／L羟喜树碱处理细胞，继续培养24h，用annexinV／PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率，用JC-1染色检测HTFs线粒体膜电位，采用Westernblot法检测HTFs中半胱氨酸天冬酶-3（caspase-3）、easpase-9及线粒体／细胞质中细胞色素C（cytC）蛋白的表达，对各组中的测量结果进行比较。结果0、0．01、0．05、0．10g／L羟喜树碱组的HTFs增生值（A450）分别为0．9716±0．0608、0．8035±0．0346、0．7048±0．0446和0．6265±0．0286，总体差异有统计学意义（F=26．372，P=0．002），0．01、0．05、0．10g／L羟喜树碱组HTFsA450值均低于对照组，差异均有统计学意义（P〈0．05），以0．10g／L羟喜树碱组HTFsA。，。值最低。AnnexinV／PI双染色检测发现，0．10g／L羟喜树碱组HTFs凋亡率为（18．72±1．41）％，明显高于对照组的（3．67±O．36）％，差异有统计学意义（t=-10．374，P=0．001）；0．10g／L羟喜树碱组HTFs中caspase-3、caspase-9蛋白的表达强度明显强于对照组。JC-1染色发现，0．10g／L羟喜树碱处理5min后细胞质中单体JC．1的绿色荧光明显强于对照组，而线粒体中聚合态JC-1的红色荧光弱于对照组。Westernblot检测发现，0．10g／L羟喜树碱组HTFs线粒体中cytC蛋白表达灰度值为0．0124±0．0016，高于对照组的0．0216±0．0096，而0．10g／L羟喜树碱组HTFs细胞质中eytC蛋白表达灰度值为0．0605±0．0022，低于对照组的0．0301±O．0016，差异均有统计学意义（线粒体：z=4．865，P：0．014；细胞质：t=-11．177，P=0．001）。结论羟喜树碱诱导HTFs凋亡．引起线粒体的稳态破坏．激活线粒体凋亡涂径。

羟喜树碱通过蛋白激酶R样内质网激酶途径促进人Tenon囊成纤维细胞自噬作用

背景 研究证实,羟喜树碱可通过蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）途径引起人Tenon囊成纤维细胞（HTFs）凋亡,细胞自噬与凋亡均为细胞在外界压力下产生的程序性死亡反应,二者关系密切,但羟喜树碱与HTFs自噬之间的关系尚不明确. 目的 探讨羟喜树碱对HTFs自噬的作用及其机制.方法 从健康成年眼球供体中取人Tenon囊组织,经组织块培养法培养细胞,并用免疫组织化学法检测细胞中波形蛋白和角蛋白的表达以鉴定培养的细胞.利用293T细胞包装pLVX-PERK慢病毒,将慢病毒转染入HTFs,通过嘌呤霉素筛选出稳定的PERK敲除细胞系.用质量浓度为0.10 g/L的羟喜树碱处理细胞5 min后继续培养24h作为实验组,未用羟喜树碱处理的细胞作为对照组.采用Western blot法检测各组HTFs中自噬相关蛋白Beclin-1、自噬相关基因5（ATG-5）、微管相关蛋白1轻链3（LC-3）表达的灰度值;采用Cyto-ID荧光染色法检测各组HTFs中自噬小体的荧光强度及数量,将各实验结果进行分析比较. 结果 0.10 g/L羟喜树碱处理组HTFs中Beclin-1、ATG-5、LC-3-Ⅰ和LC-3-Ⅱ蛋白表达的灰度值分别为0.980±0.070、1.495±0.095、0.585±0.025和0.785±0.055,明显高于对照组的0.365 ±0.045、0.765 ±0.055、0.120±0.030和0.215±0.035,差异均有统计学意义（Beclin-1：P=0.018;ATG-5：P=0.022;LC-3-Ⅰ：P=0.007;LC-3-Ⅱ：P=0.013）.荧光显微镜检测发现,羟喜树碱处理组中自噬小体的绿色荧光强于对照组.Western blot检测结果显示,PERK敲除的细胞中PERK蛋白灰度值为0.130±0.030,明显低于对照组的0.765 ±0.055,差异有统计学意义（P=0.010）,而2个组间细胞中Beclin-1、ATG-5和LC-3蛋白反应条带强度无明显差别.0.10 g/L羟喜树碱处理组HTFs中PERK蛋白表达的灰度值为1.790±0.060,较对照组的0.880±0.070明显升高,差异有统计学意义（P=0.010）.PERK敲除±0.10 g/L羟喜树碱处理组HTFs中Beclin-1、ATG-5、LC-3-Ⅰ和LC-3-Ⅱ蛋白表达的灰度值分别为0.475 ±0.045、0.390±0.040、0.055±0.015和0.075±0.025,明显低于对照±0.10 g/L羟喜树碱处理组的0.955±0.065、0.765±0.055、0.155±0.015和0.280±0.030,差异均有统计学意义（Beclin-1：P=0.026;ATG-5：P=0.031;LC-3-Ⅰ：P=0.042;LC-3-Ⅱ：P=0.034）.PERK敲除＋0.10 g/L羟喜树碱处理组细胞中自噬小体的绿色荧光强度明显低于对照＋0.10 g/L羟喜树碱处理组. 结论 羟喜树碱可能通过PERK途径诱导HTFs的自噬.

羟基喜树碱联合依托泊苷对人Tenon囊成纤维细胞凋亡的影响及其机制

背景研究表明，羟基喜树碱（HCPT）和依托泊苷（VP-16）均能诱导人Tenon囊成纤维细胞（HTFs）的凋亡，但这两种药物联合应用对体外培养的HTFs是否有协同作用尚不明确。目的观察HCPT与VP-16联合应用后在促进体外培养的HTFs凋亡方面是否有协同性，并探讨其作用机制。方法人眼Tenon囊成纤维组织取自江苏省人民医院眼库，采用组织块培养法培养和传代HTFs，采用免疫组织化学法检测HTFs中波形蛋白的表达。第4代HTFs接种于96孔板，分别将不同质量浓度的HCPT（1、5、10、50、100mg／L）、VP-16（0．6、2．5、5．0、25．0、50．0mg／L）、HCPT＋VP-16（质量比为2：1，终质量浓度分别为0．80、3．75、7．50、37．50、75．00mg／L）加入细胞培养孔处理24h，用CCK-8法检测各组药物对细胞增生的抑制率。将HTFs分为空白对照组、HCPT（50mg／L）处理组、VP-16（25mg／L）处理组、HCPT＋VP-16（37．5mg／L）处理组，药物处理24h后用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。提取细胞内总蛋白，采用Westernblot法检测各药物处理组细胞内caspase-3、活化型caspase-3、bax、bcl-2、JNK、p-JNK、Akt、p-Akt的表达水平。结果培养的细胞呈多边形或不规则形，波形蛋白表达阳性。不同质量浓度HCPT、VP-16和HCPT＋VP-16作用24h后，随着药物质量浓度的增加，对HTFs增生的抑制率增加，差异均有统计学意义（HCPT：F=41．34，P=0．00；VP-16：F=62．60，P=0．00；HCPT＋VP-16：F=46．77，P=0．00），HCPT处理组、VP-16处理组和HCPT＋VP-16处理组药物的半数抑制浓度（IC50）分别为80．99、27．93、19．81mg／L，HCPT与VP-16联合应用的合并指数（cI）为0．399，表明VP-16和HCPT具有强协同作用。空白对照组、HCPT处理组、VP-16处理组和HCPT＋VP-16处理组HTFs的凋亡率分别为（4．87±0．78）％、（11．20±1．94）％、（12．67±1．51）％和（19．77±2．01）％，差异有统计学意义（F=18．23，P〈0．01），其中HCPT处理组、VP-16处理组和HCPT＋VP-16处理组HTFs凋亡率较空白对照组明显升高，差异均有统计学意义（q’=15．67、16．32、26．88，P〈0．01）。Westernblot法检测结果表明，与空白对照组相比，HCPT处理组、VP-16处理组和HCPT＋VP-16处理组HTFs中活化型easpase．3、bax、p-JNK表达的灰度值明显增加，差异均有统计学意义（P〈0．01），且HCPT＋VP-16处理组HTFs中上述各因子表达的灰度值较HCPT处理组、VP-16处理组明显增加，差异均有统计学意义（P〈0．01），而easpase-3、JNK、Akt的表达无明显变化。与空白对照组比较，bcl-2、p-Akt在HCPT处理组、VP-16处理组和HCPT＋VP-16处理组HTFs中的表达量明显下降，HCPT＋VP-16处理组较HCPT处理组、VP-16处理组的表达量明显减少，差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论单独使用HCPT、VP-16均能诱导体外培养的HTFs凋亡，其作用均呈剂量依赖性，HCPT与VP-16联合应用有强协同作用。HTFs中p-JNK、bax的表达上调和p-Akt、bcl-2表达的下调参与联合用药引起的协同效应。

医学免疫学综合实验改革的初步探究

免疫学实验教学是培养免疫学专业人才综合能力和创新能力的重要过程,而当前免疫学实验教学存在教学模式不恰当、内容安排不合理、考核评价较局限等不足。因此,需要针对上述问题进行一定程度的综合实验教学改革。本文详细阐述了一些免疫学综合实验初步改革的教学设计思路、教学方案、考核评价及其优势和创新点。以培养“高素质的实践型、应用型、创新型的医学人才”为目标,使改革后的免疫学综合实验课程取得了较好的教学效果。

新型冠状病毒辅助蛋白ORF3a、ORF3b的致病机制研究

目的探讨新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的非结构蛋白ORF3a、ORF3b在宿主细胞中的功能。方法采用细胞免疫荧光法检测SARS-CoV-2假病毒颗粒的组装和释放量,采用实时荧光定量聚合酶链式反应和蛋白质印迹法(Western blot)检测ORF3a、ORF3b对β干扰素(IFN-β)和炎症因子表达的影响,采用Western blot检测ORF3a、ORF3b对干扰素信号通路中蛋白表达的影响。结果荧光显微镜观察结果显示,经SARS-CoV-2假病毒感染的过表达血管紧张素转化酶2(ACE2)的A549细胞(A549-ACE2)中,转染ORF3a表达载体、ORF3b表达载体的A549-ACE2细胞组装和释放出的SARS-CoV-2假病毒颗粒量均高于未转染和空载转染的A549-ACE2细胞,差异有统计学意义(P<0.001),说明ORF3a和ORF3b可促进SARS-CoV-2假病毒颗粒的组装和释放;给予ploy(I∶C)刺激并转染ORF3a或ORF3b表达载体的A549细胞,其IFN-β相对表达量低于单纯给予ploy(I∶C)刺激的A549细胞,差异有统计学意义(P<0.001),说明ORF3a、ORF3b转染表达可显著抑制ploy(I∶C)诱导的IFN-β表达水平;Western blot检测结果显示,与单纯给予IFN-β处理相比,给予IFN-β联合ORF3a或ORF3b转染处理能够抑制干扰素信号通路中关键蛋白MyD88、TRAF6的表达水平;转染ORF3a、ORF3b表达载体的A549细胞中炎症因子(肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6)相对表达量均高于空载转染的A549细胞,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.001)。结论非结构蛋白ORF3能够促进SARS-CoV-2组装和释放,诱导宿主炎症应答,并抑制宿主干扰素表达。

EV71诱导has-miR-200b表达并促进自身复制的机制

通过高通量测序检测、荧光素酶报告基因实验以及Western Blot探究miR-200b在EV71病毒复制过程中的作用。结果表明:高通量miRNA测序发现EV71感染后宿主细胞中has-miR-200b的表达显著上升,特异性抑制miR-200b的表达能够抑制EV71病毒复制;荧光素酶报告基因实验发现,miR-200b能够直接靶向结合干扰素刺激基因IFIT5的3′-UTR区域;进一步研究证实在EV71病毒感染过程中所诱导的miR-200b的表达增加能够抑制IFIT5表达进而抑制Ⅰ型干扰素应答。研究表明,EV71病毒感染能够诱导宿主细胞内miR-200b表达增加,进而抑制干扰素刺激基因IFIT5的表达,导致胞内干扰素应答抑制,从而有利EV71病毒复制。